[發明專利]一種對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法

在審

• 申請號: 202210922860.5
• 申請日: 2022-08-02
• 公開（公告）號: CN115558677A
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 劉建華;楊支力
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/78;C12N1/21;C12R1/385
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 施雨婧

1.一種對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)向細菌細胞中引入含有缺失目的基因等位基因片段的敲除質粒，篩選出敲除質粒通過單交換同源重組整合到細菌細胞染色體中的細菌細胞；

(2)轉化含有目的基因自身啟動子及其控制的野生型等位基因片段的回補質粒，篩選出含有回補質粒的細菌細胞；

(3)通過環出效應切除細菌細胞基因組中的部分片段，而后篩選出切除了目的基因并保留缺失目的基因等位基因的細菌細胞；

(4)對缺失突變體細胞控制表達并觀察表型，進行表型評估和抑制性分析。

2.根據權利要求1所述對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

(S1)用滲透物將細菌細胞制備成電感受態細胞，通過電穿孔或接合的轉化方法，引入含有用于篩選轉染成功的細胞的抗藥基因A、反向選擇標記基因a和目的基因自身啟動子加上其缺失目的基因等位基因片段的敲除質粒，敲除質粒通過單交換同源重組整合到細胞染色體中；用與抗藥基因A對應的藥物A篩選，得到敲除質粒轉染成功的細菌細胞；

(S2)轉化含有與抗藥基因A不同的抗藥基因B、用于觀察表型的基因b和目的基因自身啟動子及其控制的野生型等位基因片段的回補質粒；用與抗藥基因B對應的藥物B篩選，得到回補質粒轉染成功的細菌細胞；

(S3)使用反向選擇標記基因a進行負篩選，得到通過環出效應切除敲除質粒的細菌細胞；(S4)使用藥物A、藥物B和反向選擇標記基因a對細菌細胞進行表型檢查，細胞對反向選擇標記基因a和藥物A敏感，培養細胞；

(S5)使用引物特異性PCR對細胞染色體環出序列進行檢測，保留染色體缺失目的基因的缺失突變體細胞；

(S6)培養缺失突變體細胞，控制用于觀察表型的基因b表達并觀察細胞，進行表型評估分析。

3.根據權利要求2所述對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法，其特征在于，所述敲除質粒的制備方法包括以下步驟：

以質粒1為原料，將抗藥基因A、反向選擇標記基因a通過同源重組克隆，產生質粒1-A-a；將目的基因缺失盒克隆到質粒1-A-a中，得到敲除質粒1-A-a；目的基因缺失盒包含帶有中間缺失目的基因編碼的上游和下游序列。

4.根據權利要求2所述對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法，其特征在于，所述回補質粒的制備方法包括以下步驟：

以具有復制子的質粒2為原料，將抗藥基因B、用于觀察表型的基因b通過同源重組克隆，產生質粒2-B-b；將目的基因互補盒克隆到質粒2-B-b中，得到目的基因回補質粒2-B-b；目的基因互補盒包含自身啟動子和目的基因野生型編碼序列。

5.根據權利要求1所述對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法，其特征在于，在所述步驟(4)之后，通過目的基因的直系同源物進行功能互補分析。

6.根據權利要求1所述對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法，其特征在于，在所述步驟(4)之后，分離缺失突變體的抑制子。

7.根據權利要求6所述對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法，其特征在于，所述分離缺失突變體的抑制子的方法包括，使缺失突變體細胞自發突變，得到含有缺失目的基因等位基因的突變株。

8.根據權利要求1所述對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述對缺失突變體細胞控制表達并觀察表型，進行表型評估和抑制性分析的方法包括旁路抑制。

9.敲除PA0006基因的菌株在降低假單胞菌致病性的藥物中的應用。

10.敲除PA0006基因的菌株在研究細胞壁脂多糖O抗原生理功能中的應用。