[發明專利]一種鐵蛋白的制備方法

在審

• 申請號: 202210920629.2
• 申請日: 2022-08-02
• 公開（公告）號: CN115948308A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 張同偉;林雨楠
• 申請（專利權）人: 蘇州搏邁星源生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/11;C07K14/00;C07K1/14;C07K1/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京秉文同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11859
• 代理人: 陳少麗;孫富利

本發明提供了一種鐵蛋白的制備方法，屬于生物技術領域。該制備方法包括：構建無標簽鐵蛋白的大腸桿菌重組表達菌株；發酵大腸桿菌重組表達菌株，得到發酵液；利用高壓均質機粗提取發酵液中的鐵蛋白，得到粗提鐵蛋白；采用液相色譜純化粗提鐵蛋白，得到鐵蛋白。該制備方法采用高壓均質機對鐵蛋白重組菌的破壁提取問題，相比于傳統的超聲處理該方法效率高，可進行規模化放大，從而提高了鐵蛋白的產量。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及鐵蛋白的制備方法。

背景技術

鐵蛋白是動物、植物及微生物細胞中普遍存在的一種蛋白質，由12個或24個蛋白亞基自組裝成球形籠狀蛋白殼，內徑約8nm，外徑約12nm。鐵蛋白具有天然的籠狀結構，該結構是一個優良的生物反應器，科學家在酸性條件下利用還原劑去除天然提取的鐵蛋白的水合氧化鐵內核，得到空殼鐵蛋白，在鐵蛋白空殼內合成磁鐵礦納米顆粒。磁鐵礦納米顆粒具有良好的應用前景。

目前，獲得鐵蛋白的實驗室操作步驟包括：搖床進行擴大培養、超聲波破壁提取鐵蛋白和液相色譜純化鐵蛋白。其中，超聲波破壁也是實驗室破碎細胞最常用的方法之一，但是超聲破壁處理樣品規模小，效率低，無法規模化放大。因此，欲克服鐵蛋白產量的限制，須克服鐵蛋白重組菌的破壁提取問題。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種鐵蛋白的制備方法，能夠大規模生產鐵蛋白。

本發明實施例提供一種鐵蛋白的制備方法，包括：

構建無標簽鐵蛋白的大腸桿菌重組表達菌株；

發酵所述大腸桿菌重組表達菌株，得到發酵液；

利用高壓均質機粗提取所述發酵液中的鐵蛋白，得到粗提鐵蛋白；

采用液相色譜純化所述粗提鐵蛋白，得到所述鐵蛋白。

具體地，所述利用高壓均質機粗提取所述發酵液中的鐵蛋白的方法包括：

向所述發酵液中加入終濃度為0.5～2mM的乙二胺四乙酸溶液，得到第一混合液；

向所述第一混合液中加入磷酸緩沖鹽溶液，得到第二混合液；

用氫氧化鈉溶液調節所述第二混合液的pH值至7.0～9.0，得到第三混合液；

用所述高壓均質機在90MPar～130MPar的壓力下均質處理所述第三混合液；

向均質后的所述第三混合液中加入終濃度為0.5％～2％的聚乙二醇辛基苯基醚或聚氧乙烯單叔辛基苯基醚，得到第四混合液；

在攪拌條件下，于60～80℃加熱所述第四混合液15～30分鐘，并于10000g下離心30分鐘，得到第一上清液；

濃縮所述第一上清液，并于4℃靜置2～3天，經離心得到第二上清液，即粗提取的所述鐵蛋白。

進一步地，濃縮所述第一上清液的方法為利用中空纖維濃縮系統進行濃縮，濃縮條件為：中空纖維柱截留蛋白分子量100KDa，流速2～5L/min，壓力小于0.5psi。

具體地，所述構建無標簽鐵蛋白的大腸桿菌重組表達菌株的方法包括：

將所述鐵蛋白的序列進行密碼子優化，得到優化鐵蛋白序列；

合成所述優化鐵蛋白序列；

將所述優化鐵蛋白序列插入載體的多克隆位點上，利用酶切位點進行酶切，得到重組載體；

將所述重組載體導入大腸桿菌菌株中，構建鐵蛋白的異源表達體系并篩選正確的重組表達菌株。

具體地，所述發酵所述大腸桿菌重組表達菌株的方法包括：