[發(fā)明專利]一種鐵蛋白的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210920629.2
• 申請日: 2022-08-02
• 公開（公告）號: CN115948308A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張同偉;林雨楠
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州搏邁星源生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/11;C07K14/00;C07K1/14;C07K1/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京秉文同創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11859
• 代理人: 陳少麗;孫富利

1.一種鐵蛋白的制備方法，其特征在于，包括：

構(gòu)建無標(biāo)簽鐵蛋白的大腸桿菌重組表達(dá)菌株；

發(fā)酵所述大腸桿菌重組表達(dá)菌株，得到發(fā)酵液；

利用高壓均質(zhì)機粗提取所述發(fā)酵液中的鐵蛋白，得到粗提鐵蛋白；

采用液相色譜純化所述粗提鐵蛋白，得到所述鐵蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述利用高壓均質(zhì)機粗提取所述發(fā)酵液中的鐵蛋白的方法包括：

向所述發(fā)酵液中加入終濃度為0.5～2mM的乙二胺四乙酸溶液，得到第一混合液；

向所述第一混合液中加入磷酸緩沖鹽溶液，得到第二混合液；

用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)所述第二混合液的pH值至7.0～9.0，得到第三混合液；

用所述高壓均質(zhì)機在90MPar～130MPar的壓力下均質(zhì)處理所述第三混合液；

向均質(zhì)后的所述第三混合液中加入終濃度為0.5％～2％的聚乙二醇辛基苯基醚或聚氧乙烯單叔辛基苯基醚，得到第四混合液；

在攪拌條件下，于60～80℃加熱所述第四混合液15～30分鐘，并于10000g下離心30分鐘，得到第一上清液；

濃縮所述第一上清液，并于4℃靜置2～3天，經(jīng)離心得到第二上清液，即粗提取的所述鐵蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，濃縮所述第一上清液的方法為利用中空纖維濃縮系統(tǒng)進行濃縮，濃縮條件為：中空纖維柱截留蛋白分子量100KDa，流速2～5L/min，壓力小于0.5psi。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述構(gòu)建無標(biāo)簽鐵蛋白的大腸桿菌重組表達(dá)菌株的方法包括：

將所述鐵蛋白的序列進行密碼子優(yōu)化，得到優(yōu)化鐵蛋白序列；

合成所述優(yōu)化鐵蛋白序列；

將所述優(yōu)化鐵蛋白序列插入載體的多克隆位點上，利用酶切位點進行酶切，得到重組載體；

將所述重組載體導(dǎo)入大腸桿菌菌株中，構(gòu)建鐵蛋白的異源表達(dá)體系并篩選正確的重組表達(dá)菌株。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵所述大腸桿菌重組表達(dá)菌株的方法包括：

種子制備：將鐵蛋白表達(dá)工程菌在固體LB培養(yǎng)基上進行活化，于37℃培養(yǎng)12小時，得到單菌落；

搖床培養(yǎng)一級種子：挑取所述單菌落，接種至一級種子培養(yǎng)基中，于37℃搖床震蕩培養(yǎng)12小時，得到一級種子液；

搖床培養(yǎng)二級種子：將所述一級種子液按照種子培養(yǎng)基體積0.1％的接種量接種到二級種子培養(yǎng)基中，于37℃搖床震蕩培養(yǎng)8小時，得到二級種子；

發(fā)酵培養(yǎng)：將所述二級種子按發(fā)酵體積4％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，待所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡后補加補料培養(yǎng)基，待菌體濃度生長至OD600達(dá)到30～40之間后開始加入終濃度為0.5～1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)鐵蛋白，待OD值不再上升后，停止發(fā)酵培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述一級種子培養(yǎng)基和所述二級種子培養(yǎng)基均包括：胰蛋白胨、酵母提取物和氯化鈉，所述胰蛋白胨的濃度為10g/L，所述酵母提取物的濃度為5g/L，所述氯化鈉的濃度為10g/L。