[發明專利]Argonaute介導的一鍋法microRNA檢測體系及檢測方法

在審

• 申請號: 202210917595.1
• 申請日: 2022-08-01
• 公開（公告）號: CN115992206A
• 公開（公告）日: 2023-04-21
• 發明（設計）人: 林秋媛;陳惠;孔繼烈
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

本發明公開了一種Argonaute介導的一鍋法microRNA檢測體系及檢測方法。本發明提供了一種microRNA檢測方法，其包括將待測核酸樣本、指數擴增反應體系和microRNA檢測體系混合，形成混合反應體系，進行反應，獲得反應物中的熒光信號，實現microRNA的檢測；microRNA檢測體系包括向導DNA、Argonaute核酸酶和檢測探針，且指數擴增反應體系擴增目標物microRNA所獲得的擴增產物作為向導DNA。本發明的體系及方法首次建立了EXPAR擴增與Ago特異性剪切一體化的一鍋法檢測，實現在單個反應體系中同時擴增、剪切和單個或多個目標物檢測，避免氣溶膠污染，操作便捷、方法高效。

技術領域

本發明涉及microRNA檢測的技術領域，具體涉及一種Argonaute介導的一鍋法microRNA檢測體系及檢測方法；更具體地，涉及可編程Argonaute核酸特異性剪切酶介導的一鍋法microRNA檢測/分子診斷體系及方法。

背景技術

MicroRNA(miRNA)是一類短鏈非編碼RNA，miRNA通過靶向mRNA，進而抑制轉錄后的基因表達，在調控基因表達方面起著重要作用(Cell,2004,116(2):281-297)。miRNA豐度水平的升高或降低與疾病的發生密切相關，被作為疾病診斷、監測的重要標志物之一。例如過去幾十年的研究表明，miRNA的異常水平與腫瘤的發生、發展、轉移等密切相關，被認為是腫瘤診斷和預后的重要標志物(Nature?reviews?cancer,2006,6(4):259-269.)。由于腫瘤本身的復雜性，腫瘤標志物的敏感性和特異性較差，目前腫瘤的早期精準診斷一直是困擾著人類的一個難題。而miRNA在許多體液中穩定存在，包括血清、唾液、尿液等，其可以耐受RNA酶的降解，在一定pH和溫度下保持穩定，為腫瘤的診斷開辟了新思路。檢測循環血液中的miRNA表達水平有希望成為惡性腫瘤早期診斷最佳選擇。

核酸檢測技術包括逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse?transcription-polymerasechain?reaction,RT-PCR)、等溫擴增和高通量測序，均已經發展成熟，并廣泛應用于分子醫學診斷，但在靈敏度、特異性和操作便利性方面存在不足。此外由于miRNA片段短、種類多、序列相似性高，而復雜生物樣本的干擾物眾多，靶標含量極其微少，導致傳統方法運用于miRNA檢測時存在很大的局限性。例如PCR檢測miRNA需要復雜的設計、逆轉錄和PCR過程，靈敏度和特異性有限。高通量測序存在耗時長、費用高、步驟繁瑣等問題。目前，針對miRNA尚缺乏令人滿意的檢測方法。