[發(fā)明專利]Argonaute介導(dǎo)的一鍋法microRNA檢測體系及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210917595.1
• 申請日: 2022-08-01
• 公開（公告）號: CN115992206A
• 公開（公告）日: 2023-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林秋媛;陳惠;孔繼烈
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 北京林達(dá)劉知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

1.一種microRNA檢測方法，其包括：將待測核酸樣本、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系和microRNA檢測體系混合，形成混合反應(yīng)體系，進(jìn)行反應(yīng)，獲得反應(yīng)物中的熒光信號，實現(xiàn)microRNA的檢測；其中，

所述microRNA檢測體系包括向?qū)NA、Argonaute核酸酶和檢測探針，且所述指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增目標(biāo)物microRNA所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物作為所述向?qū)NA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的microRNA檢測方法，其中，所述Argonaute核酸酶選自來自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium?perfringens)的CpAgo核酸酶、來自巴特勒腸桿菌(Intestinibacter?bartlettii)的IbAgo核酸酶、來自格氏嗜鹽堿桿菌(Natronobacteriumgregoryi)的NgAgo核酸酶中的一種或多種；

優(yōu)選地，所述Argonaute核酸酶為來自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium?perfringens)的CpAgo核酸酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的microRNA檢測方法，其中，在所述混合反應(yīng)體系中，所述Argonaute核酸酶的含量為0.01-200nM。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的microRNA檢測方法，其中，所述的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系包括擴(kuò)增模板、DNA聚合酶、切口酶、dNTP、RNase抑制劑和酶緩沖液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的microRNA檢測方法，其中，所述的DNA聚合酶為Vent(exo-)DNA聚合酶或Bst?DNA聚合酶；和/或，

所述的切口酶為限制性核酸內(nèi)切酶或切口核酸內(nèi)切酶；

優(yōu)選的，所述的切口酶為限制性核酸內(nèi)切酶；

更優(yōu)選的，所述限制性核酸內(nèi)切酶為Nt.BstNBI。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的所述的microRNA檢測方法，其中，所述的酶緩沖液包括反應(yīng)緩沖液和NEBuffer^TMr3.1中的一種或多種。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項所述的microRNA檢測方法，其中，所述的檢測探針帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，且所述的檢測探針包括與采用指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增目標(biāo)物microRNA所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物互補的區(qū)域；

優(yōu)選地，在所述的檢測探針中，所述的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)各自獨立地位于所述的檢測探針的5’端和3’端。

8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項所述的microRNA檢測方法，其中，所述的待測核酸樣本包括來自生物樣本的核酸；

任選地，所述的生物樣本選自：血液、細(xì)胞、血清、唾液、體液、血漿、尿液、前列腺液、支氣管灌洗液、腦脊液、胃液、膽汁、淋巴液、腹腔液、糞便或其組合。

9.根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一項所述的microRNA檢測方法，其中，形成混合反應(yīng)體系，進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)條件為：在50-60℃條件下，反應(yīng)10-30min，之后在30-50℃條件下反應(yīng)10-30min。

10.根據(jù)權(quán)利要求1～9中任一項所述的microRNA檢測方法，其中，在進(jìn)行所述的microRNA檢測方法之前還包括生物樣本的預(yù)處理的步驟，其包括提取生物樣本中的總microRNA。

11.一鍋法microRNA檢測體系，其包含待測核酸樣本、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系和microRNA檢測體系；

其中，所述microRNA檢測體系包括向?qū)NA、Argonaute核酸酶和檢測探針，且所述指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增目標(biāo)物microRNA所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物作為所述向?qū)NA；

所述Argonaute核酸酶選自來自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium?perfringens)的CpAgo核酸酶、來自巴特勒腸桿菌(Intestinibacter?bartlettii)的IbAgo核酸酶、來自格氏嗜鹽堿桿菌(Natronobacterium?gregoryi)的NgAgo核酸酶中的一種或多種；

任選地，所述的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系包括擴(kuò)增模板、DNA聚合酶、切口酶、dNTP、RNase抑制劑和酶緩沖液。