[發(fā)明專利]一種皮膚干細(xì)胞制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210906273.7
• 申請日: 2022-07-29
• 公開（公告）號: CN115141795B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡波潯;劉贏瀅;謝亮;趙傳鑫;李欣;謝元進(jìn);姜舒;張蕓
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市茵冠生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 廣東省中源正拓專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44748
• 代理人: 黨沖

本發(fā)明涉及一種皮膚干細(xì)胞制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。將皮膚組織清洗消毒并離心后，用1％膠原蛋白酶IV和包含胎牛血清、甲殼素、維生素E和肌醇六磷酸的完全培養(yǎng)基混合液于37℃培養(yǎng)箱中消化，然后依次進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)，得到皮膚干細(xì)胞。本發(fā)明在皮膚組織消化過程中采用特殊培養(yǎng)基和膠原蛋白酶IV混合液，于37℃培養(yǎng)箱中消化12～36h，消除繁瑣的搖床震蕩步驟，也減少成本；采用該特殊培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，一個(gè)T25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)6～10天能收獲至少2百萬細(xì)胞量，大大縮短了原代細(xì)胞產(chǎn)出時(shí)間，更提高了原代細(xì)胞生產(chǎn)數(shù)量，為批量生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種皮膚干細(xì)胞制備方法。

背景技術(shù)

干細(xì)胞是具有自我復(fù)制和多向分化能力的細(xì)胞，可以不斷地自我更新，并在特定條件下分化成為一種或多種構(gòu)成人體組織或器官的細(xì)胞，可使組織恢復(fù)再生能力，修復(fù)其功能。研究者在人皮膚真皮下發(fā)現(xiàn)一種新的成體干細(xì)胞，將其命名為皮膚干細(xì)胞。

在當(dāng)今社會，高壓力和快節(jié)奏的生活給人們的身心健康帶來了新的挑戰(zhàn)，愛美之心，人皆有之，縱觀歷史各種人類文化都會認(rèn)為某些身體特征具有吸引力，比如高大的身材、光潔的皮膚等等，以至于可以忽略其它特征。然而，隨著年歲的增長，人體器官生理功能發(fā)生病變，功能下降，因此抗衰老的要求日益增強(qiáng)，隨著再生醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，細(xì)胞干預(yù)的療法將應(yīng)用越來越廣，簡單的說就是為機(jī)體補(bǔ)充缺乏的細(xì)胞，替換機(jī)體衰老的細(xì)胞從而使機(jī)體變得健康年輕，從而抑制衰老，使廣大朋友重獲青春健康之美。

隨著年齡的增長，皮膚會出現(xiàn)松弛、干燥粗糙、彈性下降、皺紋增多等老化現(xiàn)象，這些現(xiàn)象都與干細(xì)胞數(shù)量減少以及分泌合成功能下降或異常有關(guān)。人皮膚干細(xì)胞是皮膚真皮網(wǎng)織層中最重要的細(xì)胞，是皮膚衰老和細(xì)胞受損后的主要修復(fù)細(xì)胞之一。它不但能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化，還能分泌大量的膠原蛋白、彈性纖維蛋白及多種細(xì)胞修復(fù)因子，具有強(qiáng)大的自我更新能力，從而修復(fù)老化的皮膚。皮膚干細(xì)胞是維持皮膚彈性和韌性的重要細(xì)胞，因其特有的生物學(xué)特性，在抗皮膚衰老中起著重要的作用。

通過提取人體表面組織，經(jīng)過工藝開發(fā)培養(yǎng)出的干細(xì)胞注射到皮下，分泌膠原蛋白，膠原蛋白結(jié)構(gòu)變厚變緊密，皮膚彈性變強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)皮膚凹坑、細(xì)紋部位和損傷部位的填充，就能滿足人們對于抗衰老的需求。

皮膚為人體最大的器官，其干細(xì)胞易獲取且具有較強(qiáng)的增殖分裂能力，因此，皮膚干細(xì)胞的培養(yǎng)對結(jié)締組織相關(guān)領(lǐng)域的研究探索具有重要意義。探索和建立皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，為皮膚干細(xì)胞在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

專利公開號CN105969719A公開了一種皮膚成纖維細(xì)胞提取制備方法，首先切取人體腹部皮膚，置于含有氨芐青霉素和硫酸鏈霉素的PBS中漂洗，將漂洗后皮膚剪成小塊，加入含有膠原酶、透明質(zhì)酸酶的DMEM中，4℃條件下放置過夜，然后加入含有胰酶和EDTA的PBS消化液，離心收集細(xì)胞，用DMEM洗脫后開放培育48h，待培育細(xì)胞長成單層后，用無鈣鎂離子的PBS漂洗，加入含有胰酶和EDTA的PBS消化液消化，加入含人自體血清的a-MEM培養(yǎng)液吹打終止消化，然后傳代培養(yǎng)48h，最后離心得到皮膚干細(xì)胞。該發(fā)明公開的消化過程分為兩步，第一步在4℃條件下放置過夜，消化液為含有膠原酶、透明質(zhì)酸酶的DMEM；第二部消化液為含有胰酶和EDTA的PBS消化液。

專利CN110438067A公開了一種人皮膚成纖維細(xì)胞及其制備方法，該制備方法包括以下步驟：預(yù)處理：采集耳后皮膚組織，分離真皮層組織，用組織清洗液清洗干凈后剪碎成組織碎塊；第一次消化：將組織碎塊與組織消化液I混合消化，消化后離心去除上清液，保留沉淀；其中，組織消化液I為包含中性蛋白酶和DNA酶的生理鹽水，第二次消化：將第一次消化后保留的沉淀和組織消化液II混合消化，加入胰蛋白酶繼續(xù)消化；其中，組織消化液II為包含I型膠原酶和DNA酶的DNEM培養(yǎng)基；終止消化：加入終止液終止消化，篩去組織塊，離心，去除上清液，保留沉淀；培養(yǎng)：用選擇性培養(yǎng)基重懸沉淀，分裝培養(yǎng)。雖然第二部消化過程中公開了I型膠原酶，但其消化方法為I，在37±1℃下震蕩消化50～70min。