[發(fā)明專利]雞血藤瞬時轉(zhuǎn)化方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210906155.6
• 申請日: 2022-07-29
• 公開（公告）號: CN116004709A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦雙雙;林泉;謝月英;韋桂麗;繆劍華
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 李開成

本發(fā)明公開了一種雞血藤瞬時轉(zhuǎn)化方法，其包括以下步驟：1)構(gòu)建表達(dá)載體質(zhì)粒；2)將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并利用菌液侵染雞血藤盛花期花瓣；3)將浸染后的雞血藤花進(jìn)行遮光處理，過夜培養(yǎng)12?24h，即完成雞血藤的瞬時轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還提供了雞血藤瞬時轉(zhuǎn)化方法在研究目的基因調(diào)控雞血藤活性成分合成中的應(yīng)用。本發(fā)明建立了適用于雞血藤的農(nóng)桿菌注射滲透介導(dǎo)的瞬時表達(dá)體系，可快速、便捷、高效地獲得瞬時轉(zhuǎn)化材料，特別有助于研究雞血藤活性成分合成相關(guān)基因。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種雞血藤瞬時轉(zhuǎn)化方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

雞血藤來源于多年生木本植物密花豆Spatholobus?suberectus?Dunn的干燥藤莖，為常用中藥、“桂十味”道地藥材品種之一，本草古籍記載為“血分之圣藥”，是金雞膠囊、花紅片等中成藥的主要原料，黃酮類成分是其主要活性成分。雞血藤全基因組圖譜已完成，為功能基因研究提供了基礎(chǔ)。但對于多年生木本植物來說，遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建困難，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植株的效率低、周期長，這些阻礙了木本植物功能基因的深入研究。雞血藤無菌組織培養(yǎng)研究多年未獲成功，其穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建也一直未有突破。因此，建立一種快速、高效、便捷的基因功能鑒定方法，對于雞血藤功能基因挖掘，揭示其藥材品質(zhì)形成的分子機(jī)制，變得尤為重要。

瞬時轉(zhuǎn)化是一種快速有效的研究目的基因功能的方法，不僅為大規(guī)模的基因功能篩選提供可能。目前已在多種植物的葉、根、花、愈傷組織中得到應(yīng)用。目前瞬時轉(zhuǎn)化方法多為農(nóng)桿菌介導(dǎo)，浸染方式、浸染部位等都會影響瞬時轉(zhuǎn)化效果。因此，建立雞血藤瞬時轉(zhuǎn)化體系是進(jìn)行雞血藤功能基因研究所必需的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的一個目的是提供一種雞血藤瞬時轉(zhuǎn)化方法，其能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因在雞血藤花中的瞬時轉(zhuǎn)化，是快速研究雞血藤基因功能的有效方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種雞血藤瞬時轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

1)構(gòu)建表達(dá)載體質(zhì)粒；

2)將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并利用菌液侵染雞血藤盛花期花瓣；

3)將浸染后的雞血藤花進(jìn)行遮光處理，過夜培養(yǎng)12-24h，即完成雞血藤的瞬時轉(zhuǎn)化。

優(yōu)選的是，所述表達(dá)載體為過表達(dá)載體，將雞血藤基因SsMYB106與質(zhì)粒pBI121載體連接，構(gòu)建過表達(dá)載體質(zhì)粒pBI121-SsMYB106；雞血藤基因SsMYB106如SEQ?ID?NO.1所示。

優(yōu)選的是，步驟1)中，過表達(dá)載體質(zhì)粒攜帶有CaMV35S啟動子、Kanamycin載體抗性及報告基因。

優(yōu)選的是，所述報告基因?yàn)棣?Glucuronidase、熒光素酶、熒光蛋白中的任意一種。

優(yōu)選的是，步驟2)中，通過液氮凍融法將過表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定無誤，侵染雞血藤盛花期花瓣。

優(yōu)選的是，步驟2)中，用無菌注射器在花瓣背面輕輕摩擦出細(xì)微傷口，使用無針頭的無菌注射器將菌液于傷口處緩慢注入菌液，在花瓣兩邊分別進(jìn)行注射，使注射后的花瓣呈半透明狀。

一種雞血藤瞬時轉(zhuǎn)化方法在研究目的基因調(diào)控雞血藤活性成分合成中的應(yīng)用。