[發(fā)明專利]一種組織工程表皮的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210896315.3
• 申請日: 2022-07-28
• 公開（公告）號: CN115227876B
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 檀東安;黃昶灝;黃鳳杰;聶雅婷
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省海西細(xì)胞生物工程有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/60;C12N5/071
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 彭琴;蔡學(xué)俊

本發(fā)明提供一種組織工程表皮的制備方法，使用自主研發(fā)的無血清培養(yǎng)基，無需胎牛血清、TPA等物質(zhì)，又能保證黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞得到高效擴(kuò)增；采用多種酶多步驟的消化方法，將表皮和真皮完美分離開后再將角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞消化下來，從根源上就有效杜絕了成纖維細(xì)胞的污染，從而無需滋養(yǎng)層細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞與組織體外培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種組織工程表皮的制備方法。

背景技術(shù)

白癜風(fēng)是一種發(fā)病機(jī)制不明的皮膚病，全球每200人中就有1人受到白癜風(fēng)的影響。目前已經(jīng)提出了幾種潛在的白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制，包括自身免疫、神經(jīng)體液因素和自身細(xì)胞毒性等，不過白癜風(fēng)可能是由多種因素引起的，發(fā)病部位覆蓋全身，常見于面部、軀干、四肢。白癜風(fēng)是局部黑色素細(xì)胞破壞引起的色素脫失的皮膚病，發(fā)病區(qū)域為邊界清晰的皮膚白斑，臨床上較常見的以皮膚顏色減退、變白，境界鮮明，無自覺癥狀為特征。目前白癜風(fēng)治療方案主要為藥物、紫外照射及表皮移植等。傳統(tǒng)的表皮移植方案是從健康皮膚上取下一部分正常膚色的皮膚，然后移植到患病的白斑區(qū)，移植比例一般都小于1：1。大面積的白斑患者需要多次重復(fù)進(jìn)行移植手術(shù)，過程比較痛苦。

組織工程表皮的培養(yǎng)可實現(xiàn)皮膚面積由小變大的擴(kuò)增，很好地解決了移植時需大面積取皮的問題。組織工程表皮主要由角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞組成。現(xiàn)階段，將組織工程表皮應(yīng)用于臨床主要面臨兩個問題：1.使用無血清培養(yǎng)基讓角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞共同有效擴(kuò)增，2.擴(kuò)增過程中保持黑色素細(xì)胞的功能。首先，組織工程表皮培養(yǎng)過程中容易受到成纖維細(xì)胞污染，所以現(xiàn)階段都是采用RMD9小鼠胚胎細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞來抑制成纖維細(xì)胞的生長。但是RMD9小鼠胚胎細(xì)胞是異種細(xì)胞，雖然經(jīng)過滅活處理，但是分泌的外囊泡依然會被角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞所吸收，因此應(yīng)用于臨床是有極大潛在風(fēng)險的。其次，由于黑色素細(xì)胞在普通培養(yǎng)基中很難生長，所以目前商業(yè)化的黑色素培養(yǎng)基中會添加十四烷酞佛波醇乙酯(TPA)、霍亂毒素?(cT）、牛垂體提取物（BPE）、胎牛血清（FBS）等其中一種或多種物質(zhì)。但是TPA是公認(rèn)的致癌物，CT對人體是有毒性的，BPE和FBS來源于異種，使用含有這些物質(zhì)培養(yǎng)出來的組織工程表皮應(yīng)用于臨床是有極大潛在風(fēng)險的。因此，現(xiàn)在亟需開發(fā)一種采用無滋養(yǎng)層細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的組織工程表皮的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種無滋養(yǎng)層細(xì)胞、無血清制備組織工程表皮的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種組織工程表皮的制備方法，具體步驟如下：

1、人組織工程表皮細(xì)胞的分離

取人大腿內(nèi)側(cè)正常皮膚3cm×3cm，用75%酒精消毒1min，然后用剪刀和鑷子將結(jié)締組織和脂肪組織剔除。接著用生理鹽水清洗7遍，用手術(shù)刀將皮膚組織切成0.5cm×0.5cm大小，加入6mL?0.2wt%?I型膠原酶（215U/mg）酶液，4℃冰箱消化過夜。第二天用鑷子將表皮從真皮上剝離下來，用生理鹽水漂洗3次。將表皮剪碎，加入4mL?0.2wt%?I型膠原酶（215U/mg）酶液，37℃搖床消化2h。隨后加入1mL?0.25wt%的胰蛋白酶（Gibco），37℃搖床消化30min。最終加入等體積的胰酶抑制劑（Gibco，R002100）終止消化，吹打，將細(xì)胞懸液過70μm細(xì)胞篩，500g離心5min，棄上清，加入生理鹽水重懸細(xì)胞，得到人組織工程表皮細(xì)胞懸液，取樣計數(shù)。

2、組織工程表皮細(xì)胞的培養(yǎng)及觀察

將細(xì)胞懸液500g離心5min，棄上清，加入自主研發(fā)的含終濃度為0.1mM?5-BrdU（sigma，B5002）的無血清培養(yǎng)基，按照2×10^5?cells/孔的量接種到六孔板里，置于37℃條件下培養(yǎng)。5-BrdU能有效地抑制成纖維細(xì)胞的污染。每隔兩天鏡下觀察一次，培養(yǎng)四天后更換成新鮮的無血清培養(yǎng)基，隨后每兩天換液一次。當(dāng)鏡下觀察到角質(zhì)細(xì)胞克隆每個克隆含有100-150個細(xì)胞時即可執(zhí)行傳代步驟。