[發明專利]一種組織工程表皮的制備方法

有效

• 申請號: 202210896315.3
• 申請日: 2022-07-28
• 公開（公告）號: CN115227876B
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 檀東安;黃昶灝;黃鳳杰;聶雅婷
• 申請（專利權）人: 福建省海西細胞生物工程有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/60;C12N5/071
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 彭琴;蔡學俊

1.一種組織工程表皮的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）人組織工程表皮細胞的分離

取人大腿內側正常皮膚3cm×3cm，用75%酒精消毒1min，然后用剪刀和鑷子將結締組織和脂肪組織剔除，接著用生理鹽水清洗7遍，用手術刀將皮膚組織切成0.5cm×0.5cm大小，加入6mL?0.2wt%?I型膠原酶酶液，4℃冰箱消化過夜，第二天用鑷子將表皮從真皮上剝離下來，用生理鹽水漂洗3次，將表皮剪碎，加入4mL?0.2wt%?I型膠原酶酶液，37℃搖床消化2h，隨后加入1mL?0.25wt%的胰蛋白酶，37℃搖床消化30min，最終加入等體積的胰酶抑制劑終止消化，吹打，將細胞懸液過70μm細胞篩，500g離心5min，棄上清，加入生理鹽水重懸細胞，得到人組織工程表皮細胞懸液，取樣計數；

（2）組織工程表皮細胞的培養及觀察

將細胞懸液500g離心5min，棄上清，加入含終濃度為0.1mM?5-BrdU的無血清培養基，按照2×10⁵cells/孔的量接種到六孔板里，置于37℃條件下培養，每隔兩天鏡下觀察一次，培養四天后更換成新鮮的無血清培養基，隨后每兩天換無血清培養基一次，當鏡下觀察到角質細胞克隆每個克隆含有100-150個細胞時即可執行傳代步驟；

（3）組織工程表皮細胞的傳代

去除培養基，加入0.02wt%的EDTA清洗細胞兩次，然后再加入0.02wt%的EDTA于37℃孵育20min，接著加入0.05wt%的胰蛋白酶消化1-3min，再加入等體積的胰酶抑制劑終止消化，500g離心5min，棄上清，加入無血清培養基，接種到60mm培養皿中，按照1個孔傳1個60mm培養皿的比例傳代；

（4）組織工程表皮細胞的融合

傳代后每兩天換一次無血清培養基，直至表皮細胞完全融合，接著改為每天換液，表皮細胞開始重疊生長，并分化增厚成多層的層狀表皮；

（5）組織工程表皮的剝離

往培養液里加入終濃度為0.1mg/mL的分散酶，37℃孵育15-20min，用鑷子從邊緣開始往中間方向將組織工程表皮從培養皿上剝離下來，用pH?7.2、1×PBS緩沖液清洗兩遍后，將表皮轉移到新的60mm培養皿中，4℃冷藏，待質檢合格后即可用于臨床移植；

所述無血清培養基為在DMEM/F12培養基中加入10g/L人血白蛋白，10mg/L人胰島素，6.5mg/L人轉鐵蛋白，7.5μg/L亞硒酸鈉，3mg/L氨基乙醇，4mM谷氨酰胺，0.5mg/mL環磷酸腺苷，30ng/mL人骨形態發生蛋白4，1nM?α-黑色素細胞刺激素，10ng/mL肝細胞生長因子，1μg/mL粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，0.6μg/mL堿性成纖維細胞生長因子，50μM干細胞生長因子，2mg/L三碘甲狀腺原氨酸，10ng/mL表皮生長因子，0.5μg/mL異丙腎上腺素，10nM內皮素-1，10nM內皮素-3，0.4μg/mL氫化可的松和10μM?ROCK抑制劑Y-27632；其中，所述DMEM/F12培養基為DMEM和F12按照3：1體積比例的混合液。