[發明專利]一種重組解脂耶氏酵母菌及其在生產赤蘚糖醇中的應用

在審

• 申請號: 202210893115.2
• 申請日: 2022-07-27
• 公開（公告）號: CN115717112A
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 饒志明;楊樹玲;徐美娟;楊套偉;張顯
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/02;C12N9/10;C12N9/12;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/81;C12P7/18;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了一種重組解脂耶氏酵母菌及其在生產赤蘚糖醇中的應用，屬于生物工程技術領域。本發明所述重組解脂耶氏酵母基因組中Ku70基因已缺失，并且運用質粒pINA1269組合過表達了GUT1、GUT2、TKL1和TAL1基因。本發明提供了一種可高產赤蘚糖醇的重組解脂耶氏酵母Y?11/pINA1269?GUT1?TKL1?GUT2?TAL1，將此重組解脂耶氏酵母接種至5L發酵罐中以粗甘油為碳源發酵120h，即可使發酵液中赤蘚糖醇的濃度高達110±1.1g/L、轉化率高達61％。

技術領域

本發明涉及一種重組解脂耶氏酵母菌及其在生產赤蘚糖醇中的應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

赤蘚糖醇，又名1,2,3,4-丁四醇，是一種具有甜味的四碳糖醇，天然存在于海藻、真菌、水果和發酵食品中。臨床研究和動物毒理學試驗發現，赤蘚糖醇在人體內不被代謝，攝取的赤蘚糖醇90％通過腎臟過程排泄。由于赤蘚糖醇特殊的營養特性，近年來被廣泛應用于食品和醫藥等領域。赤蘚糖醇主要有以下幾個方面：(1)增加食物甜度。赤蘚糖醇是一種甜味劑，甜度是蔗糖的60％-70％，入口有清涼的甜味，一般加入蛋糕、糖果、飲料等食品中使用。(2)幫助減肥。赤蘚糖醇雖然甜，但是沒有熱量，是天然零熱量的甜味劑，對于蛋糕類產品，添加赤蘚糖醇可以至少減少30％的熱量，并且使用后不會帶來負面的影響，吃后可幫助減肥，非常適合想要瘦身的人群替代糖食用。(3)保護口腔。很多人吃糖擔心會齲齒，而赤蘚糖醇這種代糖不會被口腔細菌所利用，因此不會造成牙齒損傷，還能減少口腔細菌滋生，有效保護口腔健康。

目前，赤蘚糖醇的生產方法主要有微生物發酵法和化學合成法。化學合成法主要是用酸堿處理經高碘酸氧化過的淀粉或纖維素，高溫高壓下加氫還原獲得，但產物中副產物較多，收率低，產物較難分離，難以實現工業化。相對于化學合成法制備赤蘚糖醇，微生物發酵法生產過程溫和易控制、環境污染少、產品安全，更具有生產優勢。因此，目前常利用微生物發酵法生產赤蘚糖醇。

Huiling等人過表達分離出編碼兩種新型赤蘚糖還原酶(ER)的基因g141.t1(YALI0D07634g)和g3023.t1(YALI0C13508g)導致赤蘚糖醇產量平均提高14.7％，生產力提高31.2％。并通過分別過表達編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因ZWF1和GND1來平衡NADPH輔因子代謝，使得赤蘚糖醇產量提高5％，生產力提高50％(具體可見參考文獻：Huiling,C.,Siqi,W.,Muhammad,B.,Xuemei,G.,Can,Z.,Patrick,F.,Hairong,C.,2018.Identification,characterization of two NADPH-dependenterythrose reductases in the yeast Yarrowia lipolytica and improvement oferythritol productivity using metabolic engineering.Microb Cell Fact.17,133.)，但是目前只有少數以甘油為碳源來生產赤蘚糖醇，尤其是粗甘油。

發明內容

為提高現有技術當中的赤蘚糖醇的生產菌株的產量及產率，以及實現生物柴油的廢棄物粗甘油的重新利用，本發明提供了一種重組解脂耶氏酵母。

所述生物柴油的廢棄物粗甘油主要成分為(w/w)：甘油80-85％，鈉鹽2.0％，甲醇10～15％，其他有機物2.5％和水2％。

本發明提供了一種重組解脂耶氏酵母，所述重組解脂耶氏酵母菌為，敲除了出發菌株解脂耶氏酵母菌的Ku70基因，同時過表達了來源于解脂耶氏酵母菌的甘油激酶基因GUT1、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GUT2、轉酮酶基因TKL1和轉醛酶基因TAL1。

在本發明的一種實施方式中，所述Ku70基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白，所述Ku70基因的NCBI Genebank登錄號為：2910012。