[發(fā)明專利]一種過表達(dá)ALK4基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請日: 2022-07-27
• 公開（公告）號: CN115927475A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周勇;蘇晶晶
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/54;C12N5/10
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本發(fā)明公開了一種過表達(dá)ALK4基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，包括：構(gòu)建高滴度的ALK4過表達(dá)慢病毒，感染目的細(xì)胞株，通過在傳代過程中采用中濃度的嘌呤霉素對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株進(jìn)行兩次懸浮篩選，獲得高效、穩(wěn)定的ALK4過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。相對于傳統(tǒng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建方法，本發(fā)明提供的構(gòu)建方法通過兩次懸浮篩選將篩選時間縮短至4天，且不需要低濃度嘌呤霉素進(jìn)行后續(xù)維持培養(yǎng)，克服了篩選步驟繁瑣，時間成本高的難題，并可實(shí)現(xiàn)100%的轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明的方法應(yīng)用于高效、穩(wěn)定的ALK4過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建，為深入探究ALK4的作用機(jī)制提供一種可靠的研究基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，具體而言，涉及ALK4基因過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

活化素受體樣激酶4（activin?receptor-like?kinase?4，ALK4）是位于細(xì)胞膜上的一類Ⅰ型活化素受體，隸屬TGF-β受體超家族，在組織中廣泛表達(dá)，是參與調(diào)控機(jī)體生理及病理過程的關(guān)鍵因子。ALK4的功能涉及胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)分化、生殖細(xì)胞發(fā)育、腫瘤形成及免疫抑制等，其作用主要通過磷酸化Smad2/3信號通路分子C端的絲氨酸殘基，除外Smad2/3信號通路還可通過MAPKs、Akt/PI3K、Wnt/β-catenin等，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。ALK4的作用廣泛，研究意義大，有著極大的市場應(yīng)用場景。

研究特定基因的功能最常用的手段是在宿主細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定過表達(dá)或者沉默該基因，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株；與瞬時轉(zhuǎn)染相比，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株便于長期觀察基因?qū)τ诩?xì)胞功能的影響，因此穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是開展基因功能研究、靶點(diǎn)驗(yàn)證及藥物篩選的重要工具。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建一般分為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和病毒轉(zhuǎn)染法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染周期長且效率低；應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株有更高的效率，且適用于大部分難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，是構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株的理想方法。但傳統(tǒng)的利用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株是一個復(fù)雜的過程，首先需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索合適的慢病毒MOI值（病毒感染復(fù)數(shù)），從而確定篩選藥物劑量；再進(jìn)行慢病毒感染細(xì)胞，感染72h后加入預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的篩選藥物劑量進(jìn)行篩選，每天或隔天更換新鮮的含藥培養(yǎng)基，藥物篩選至少持續(xù)14天，在之后的培養(yǎng)過程中需繼續(xù)使用含一半藥物劑量或低藥物劑量的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以防止插入基因的丟失，保證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率。

由于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株不同，感染病毒最適MOI值不同，構(gòu)建新的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株均需進(jìn)行繁瑣漫長的預(yù)實(shí)驗(yàn)步驟，在后續(xù)的培養(yǎng)過程中還需長期持續(xù)加入藥物來維持，增加細(xì)胞污染的風(fēng)險。此外，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選，一般為多克隆或混克隆篩選，熒光強(qiáng)度通常強(qiáng)弱夾雜，很難使轉(zhuǎn)染率達(dá)到100%?，這無疑為穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建帶來更大的困難。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本申請的技術(shù)方案如下：

一種過表達(dá)ALK4基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建方法，構(gòu)建步驟如下：

1)?構(gòu)建慢病毒載體：將ALK4基因插入過表達(dá)慢病毒載體質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，獲得陽性質(zhì)粒，即ALK4基因過表達(dá)慢病毒載體質(zhì)粒；

2)?慢病毒包裝：將所述ALK4基因過表達(dá)慢病毒載體質(zhì)粒與病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得ALK4基因重組慢病毒；

3）細(xì)胞轉(zhuǎn)染及懸浮篩選：將所述ALK基因重組慢病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞株，消化并重懸轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，于培養(yǎng)基中加入4-6μg/mL嘌呤霉素對細(xì)胞進(jìn)行至少一次懸浮篩選，得到高效穩(wěn)定的ALK4基因過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

進(jìn)一步地，上述步驟3）中細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后消化細(xì)胞，用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種至新的培養(yǎng)皿中，接種的同時于培養(yǎng)基中加入5μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行第一次篩選，12h后進(jìn)行換液，待細(xì)胞長滿后，再次消化細(xì)胞，用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種至新的培養(yǎng)皿中，再次加入5μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行第二次篩選，12h后更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液，換液后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株轉(zhuǎn)染率達(dá)到100％。