[發明專利]一種過表達ALK4基因的穩轉細胞株的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202210889347.0
• 申請日: 2022-07-27
• 公開（公告）號: CN115927475A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 周勇;蘇晶晶
• 申請（專利權）人: 重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/54;C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種過表達ALK4基因的穩轉細胞株的構建方法，其特征在于：構建步驟如下：

1)構建慢病毒載體：將ALK4基因插入過表達慢病毒載體質粒中，轉化感受態，獲得陽性質粒，即ALK4基因過表達慢病毒載體質粒；

2)慢病毒包裝：將所述ALK4基因過表達慢病毒載體質粒與病毒包裝輔助質粒共轉染細胞，獲得ALK4基因重組慢病毒；

3）細胞轉染及懸浮篩選：將所述ALK基因重組慢病毒轉染目的細胞株，消化并重懸轉染后的細胞，于培養基中加入4-6μg/mL嘌呤霉素對細胞進行至少一次懸浮篩選，得到高效穩定的ALK4基因過表達穩轉細胞株。

2.根據權利要求1或2所述的一種過表達ALK4基因的穩轉細胞株的構建方法，其特征在于，步驟3）中細胞轉染72h后消化細胞，用新鮮的培養基重懸細胞并接種至新的培養皿中，接種的同時于培養基中加入5μg/mL嘌呤霉素進行第一次篩選，12h后進行換液，待細胞長滿后，再次消化細胞，用新鮮的培養基重懸細胞后接種至新的培養皿中，再次加入5μg/mL嘌呤霉素進行第二次篩選，12h后更換為正常細胞培養液，換液后于熒光顯微鏡下觀察轉染效果，穩轉細胞株轉染率達到100％。

3.根據權利要求1所述的一種過表達ALK4基因的穩轉細胞株的構建方法，其特征在于：步驟1）和步驟2）中所述的過表達慢病毒骨架載體質粒為pLVX-mcmv-Zsgreen1-Puro、病毒包裝輔助質粒為psPAX2、病毒包裝輔助質粒為pMD2.G，上述三質粒共同組成慢病毒包裝系統。

4.根據權利要求1所述的一種過表達ALK4基因的穩轉細胞株的構建方法，其特征在于，步驟2）中所述獲得的ALK4基因重組慢病毒的病毒滴度不小于10⁸TU/mL。

5.根據權利要求1所述的一種過表達ALK4基因的穩轉細胞株的構建方法，其特征在于，步驟3）中ALK基因重組慢病毒轉染目的細胞株的過程中，以Lipofectamine?2000作為轉染試劑，以MOI為100進行轉染，并加入終濃度為5μg/mL的Polybrene，以提高轉染效率。

6.權利要求1～5任一項所述的一種過表達ALK4基因的穩轉細胞株的構建方法在構建ALK4過表達型穩轉細胞株的應用。