[發明專利]一種高效雜交瘤融合方法

在審

• 申請號: 202210878628.6
• 申請日: 2022-07-25
• 公開（公告）號: CN115947861A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 鄧加武;王明強;呂奕;芮兵
• 申請（專利權）人: 南京佰抗生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N15/06
• 代理公司: 南通英諾威訊專利代理事務所(普通合伙) 32508
• 代理人: 范鑫鑫

本發明公開了一種高效雜交瘤融合方法，具體方法為構建IL2信號肽、特定的CD19scfv蛋白和CD28跨膜結構域融合表達質粒載體；上述載體在骨髓瘤細胞SP2/0中轉錄翻譯形成融合蛋白（命名為MGCP）并被轉運至細胞表面；骨髓瘤細胞表面的MGCP蛋白可識別結合小鼠脾細胞表面的CD19蛋白，通過上述兩種蛋白的結合可實現骨髓瘤細胞和脾細胞在物理空間上的定向緊密貼合；在PEG和電擊誘導融合時，兩種細胞的融合效率可提升10?20倍。

技術領域

本發明屬于抗體的制備及序列測定領域，具體涉及一種高效雜交瘤融合方法。

背景技術

雜交瘤技術是在正常體細胞融合的基礎上發展而來的，Kohler和Milstein在1975年首次實現免疫小鼠的脾臟B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，形成了B淋巴細胞-骨髓瘤細胞雜合體，此雜合體既具有骨髓瘤細胞能在體外培養中快速無限增殖的特點，又具有B淋巴細胞可分泌單克隆抗體的優點。傳統經典的雜交瘤技術是利用PEG將HGPRT基因缺陷型骨髓瘤細胞SP2/0與免疫動物的脾細胞進行融合，利用HAT選擇性培養基可將正確融合的雜交瘤細胞篩選和培養出來。再通過常規的檢測技術如ELISA、FACS等，將能分泌針對特定蛋白單克隆抗體的陽性雜交瘤克隆篩選出來，利用有限稀釋的方法對陽性克隆進行亞克隆，亞克隆后得到的細胞即是能分泌均一性單克隆抗體的細胞。

傳統的雜交瘤技術雖然實現了單克隆抗體分泌細胞的永生化，但存在著細胞融合效率較低的問題，在融合體系中可能存在大量未融合的骨髓瘤細胞、脾細胞以及錯誤融合的骨髓瘤細胞-骨髓瘤細胞、脾細胞-脾細胞等，骨髓瘤細胞和脾細胞融合率約為幾萬分之一；同時使用高濃度的PEG對細胞具有毒害作用，不利于后續融合細胞的培養和篩選。

發明內容

傳統的雜交瘤融合技術的融合效率較低，不能有效提供龐大的抗體庫進行篩選高質量抗體，為解決融合效率低的問題，本發明提供一種高效雜交瘤融合方法。

在融合反應發生前脾細胞和骨髓瘤細胞通過細胞表面的配體-受體蛋白特異性性識別結合，上述兩種細胞的緊密結合提高融合時脾細胞和骨髓瘤細胞發生細胞膜融合的概率，具體方法為：

S1、構建IL2信號肽、特定的CD19scfv蛋白和CD28跨膜結構域融合序列，融合蛋白命名為MGCP，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

S2、對上述融合蛋白MGCP氨基酸序列對應的核苷酸序列進行密碼子優化，得到優化后的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；

S3、將上述核苷酸序列委托合成后構建至PLVX-puro慢病毒表達載體，上述載體轉染骨髓瘤細胞SP2/0后轉錄翻譯形成融合蛋白MGCP并被轉運至細胞表面，MGCP識別結合小鼠脾細胞表面的CD19蛋白，通過上述兩種蛋白的結合可實現骨髓瘤細胞和脾細胞在物理空間上的定向緊密貼合。在PEG和電擊誘導融合時，兩種細胞的融合效率可提升10-20倍。

融合蛋白MGCP經優化后的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。