[發(fā)明專利]一種具有高熱穩(wěn)定性的PET水解酶IsPETase-cSP突變酶及編碼基因及工程菌

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210875888.8
• 申請(qǐng)日: 2022-07-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116179508A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 齊崴;尤生萍;殷慶典;蘇榮欣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/18
• 分類號(hào): C12N9/18;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C08J11/10;C08L67/02;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

本發(fā)明公開(kāi)了一種具有高熱穩(wěn)定性的PET水解酶IsPETase?cSP突變酶及編碼基因及工程菌，一種具有高熱穩(wěn)定性的PET水解酶IsPETase?cSP突變酶，命名為IsPETasesupgt;S92P/D157A/supgt;?cSP，所述IsPETasesupgt;S92P/D157A/supgt;?cSP的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，差式掃描熒光法測(cè)得其熔融溫度大幅提升，熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。使用IsPETasesupgt;S92P/D157A/supgt;?cSP降解PET膜，降解效果顯著提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶工程和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有高熱穩(wěn)定性的PET水解酶IsPETase-cSP突變酶及編碼基因、含有該編碼基因的質(zhì)粒及工程菌。

背景技術(shù)

聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)是最豐富的聚酯塑料，由取自原油的對(duì)苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通過(guò)酯鍵相連構(gòu)成。PET具有合成簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、堅(jiān)固耐用等特性，PET產(chǎn)品包括纖維級(jí)PET和非纖維級(jí)PET(如瓶類、薄膜和工程塑料等)，包裝是PET最大的非纖維級(jí)應(yīng)用市場(chǎng)，也是增速最快的領(lǐng)域。目前大部分瓶裝水、軟飲料都使用PET進(jìn)行灌裝；PET在食品、藥品、化妝品和日用化學(xué)品包裝等領(lǐng)域也得到更廣泛的應(yīng)用。

隨之而來(lái)的是大量的PET通過(guò)生產(chǎn)或廢物處理的方式被引入到環(huán)境中，在全球生態(tài)系統(tǒng)中累積從而導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境破壞。PET具有高比例的芳香族對(duì)苯二甲酸酯單元，會(huì)降低鏈遷移率，因此是一種極難水解的聚酯，在自然界中可存在16-48年。目前，PET塑料主要處理方法是填埋、焚燒、熱解和化學(xué)降解，均存在對(duì)環(huán)境二次污染，而且超4000萬(wàn)噸/年P(guān)ET塑料被遺棄/填埋至自然界中，造成全球污染極其嚴(yán)重。

近年，生物處理技術(shù)由于具有高效降解、低經(jīng)濟(jì)成本、綠色環(huán)保等特點(diǎn)被逐步應(yīng)用到廢棄塑料的處理當(dāng)中。目前，在PET塑料的酶法降解領(lǐng)域已取得了較好的研究進(jìn)展，為其進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)工業(yè)水平的循環(huán)利用提供了可能。

迄今為止，已經(jīng)鑒定出許多PET水解酶，酯酶、脂肪酶或角質(zhì)酶形式的PET水解酶是研究最廣泛的塑料降解酶。但這些PET水解酶大多需要在50℃以上的溫度條件下對(duì)PET進(jìn)行降解，在常溫下表現(xiàn)出極低的活性，因此利用這些酶無(wú)法對(duì)遺棄在自然界中的PET塑料實(shí)現(xiàn)就地降解。

2016年，日本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一種將PET作為主要能量和碳源的細(xì)菌Ideonellasakaiensis?201-F6，隨后從中鑒定出PET水解酶IsPETase和MHETase，IsPETase首先將PET聚合物水解成MHET，然后類阿魏酸酯酶MHETase將MHET進(jìn)一步水解成TPA和EG。與其他脂肪酶或角質(zhì)酶對(duì)對(duì)硝基苯酯的高活性相比，IsPETase更偏好PET底物。與低結(jié)晶度角質(zhì)酶LCC、枯萎鐮刀菌角質(zhì)酶和Thermififida?fusca水解酶相比，在30℃下IsPETase對(duì)PET膜的水解活性分別高5.5、88、120倍。盡管IsPETase在迄今為止在中等溫度下測(cè)試的酶中表現(xiàn)出最強(qiáng)的PET降解活性，但其較差的熱穩(wěn)定性仍然限制了其在塑料廢物處理中的應(yīng)用。

因此，亟需一種熱穩(wěn)定性強(qiáng)能夠長(zhǎng)時(shí)間保持活性，進(jìn)而提升降解PET產(chǎn)量的酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有顯著增強(qiáng)熱穩(wěn)定性，使得降解PET反應(yīng)的產(chǎn)量顯著提升的具有高熱穩(wěn)定性的PET水解酶IsPETase-cSP突變酶。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼具有高熱穩(wěn)定性的PET水解酶IsPETase-cSP突變酶的基因。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有上述基因的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種含有上述重組質(zhì)粒的工程菌。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供具有高熱穩(wěn)定性的PET水解酶IsPETase-cSP突變酶在水解PET中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：