[發(fā)明專利]一種多肽環(huán)肽的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210856468.5
• 申請日: 2022-07-19
• 公開（公告）號: CN116178503A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設計）人: 吳剛;盧云宇;吳麗勇;程柳行行;雷肖璇
• 申請（專利權）人: 杭州彗搏科技有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K7/08;C07K7/06;C07K1/04;C07K1/107;C07K1/34;C07K1/14;A61K38/16;A61K38/10;A61K38/08;A61P17/02;A61P17/16
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧;曹小燕

本發(fā)明提供了一種多肽環(huán)肽的制備方法，通過特定條件下的疊氮?炔環(huán)加成反應，制得一系列帶有三唑環(huán)的組胺素首尾環(huán)肽，其活性與線性組胺素相比提高了1000倍以上，能以線性組胺素千分之一的劑量，達到線性組胺素相同的效果，高于已有的組胺素環(huán)肽，且相對于二硫鍵環(huán)化肽擁有顯著提升的穩(wěn)定性和抗生物代謝降解作用，相對于Sortase?A酶法環(huán)化肽明顯改善了溶解性，構象獨特。整個環(huán)化過程溫和、簡便、高效，并能制得高純度的組胺素首尾環(huán)肽，可用于制備抗衰、修復的護膚品、保健品或藥品，具有非常好的規(guī)模化產業(yè)化前景。

本申請主張中國在先申請，申請?zhí)?202110851741.0，申請日2021年7月27日的優(yōu)先權；其所有的內容作為本發(fā)明的一部分。

技術領域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術及個人護理領域，具體而言，涉及一種多肽環(huán)肽的制備方法。

背景技術

很多在體外具有很好的生物活性和穩(wěn)定性的直鏈肽，進入體內后活性很快消失。因為體內環(huán)境復雜，存在各種各樣的酶。直鏈肽在酶的作用下容易被降解代謝，進而失去活性。為了得到生物活性好、半衰期長，受體選擇性更高的多肽，文獻報道過很多多肽修飾的方法，其中包括將直鏈肽改造成環(huán)肽。這種大環(huán)分子具有明確的固定構象，能夠與受體更好地契合，且對氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低。因此環(huán)肽的代謝穩(wěn)定性和生物利用度遠遠高于直鏈肽。

環(huán)肽根據(jù)環(huán)合方式分為首尾相連環(huán)肽(Head-to-tail)、側鏈和側鏈相連環(huán)肽(Sidechain-to-sidechain)、側鏈和端基相連環(huán)肽(Sidechain-to-end)、含二硫橋的環(huán)肽(Disulfid?e-bridge)、訂書肽(Stapled?Peptide)、以及含有其他橋連結構的環(huán)肽。從合成方法上講，首尾相連的環(huán)肽的合成難度最大。因為直鏈肽的肽鍵具有很強的p鍵特征，分子更偏愛形成反式構象，呈舒展狀態(tài)，造成屬于反應中心的端基的羧基和氨基在空間上距離較遠，不利于發(fā)生分子內縮合反應，而是有利于分子間縮合。

首尾相連的環(huán)肽通常是N端和C端游離的直鏈肽在稀溶液中(10^-3～10^-4M)由羧基和氨基形成酰氨鍵來合成。直鏈前體中的氨基酸種類和數(shù)目對成環(huán)的難易程度和環(huán)肽的收率起著至關重要的作用。

由于環(huán)肽的前體——直鏈肽所包含的氨基酸的數(shù)目和種類的千差萬別，造成了環(huán)肽合成方法的多樣化。對某種直鏈肽表現(xiàn)出高效、快速縮合作用的試劑和方法對另外一種肽鏈就可能變得低效或無效。因此，根據(jù)目標環(huán)肽的序列尋找對應的環(huán)肽合成方法必須通過長期認真的探索和艱辛的努力。

首尾環(huán)化是提高肽結構剛度和穩(wěn)定性的一種重要方法。由于外切蛋白酶，如氨肽酶或羧肽酶，可以識別直鏈肽的N端或C端基團進而將其水解。因此，相比直鏈肽，環(huán)肽對酶的蛋白水解更有抵抗力。環(huán)狀結構預先限制了環(huán)狀肽的構象，封閉了兩端暴露的氨基和羧基，使得酶切效果變差，從而降低了受體結合過程中的熵成本。這一特征增加了它們對受體和蛋白質靶點的結合親和力和特異性。因此，它們適用于探測和調節(jié)蛋白-蛋白的相互作用。通過適當?shù)脑O計，環(huán)肽可以模擬作為受體識別關鍵模塊的蛋白質二級結構(如α螺旋和β發(fā)夾)，它們是受體識別的關鍵模塊。所有這些有利的藥理特征都使環(huán)肽成為潛在的候選藥物。

肽鏈的合成方法主要有液相合成和固相合成。液相合成使用完全保護的線性前體(兩個環(huán)化末端除外)，在偶聯(lián)試劑存在下的直接偶聯(lián)。然而，這種策略存在幾個缺點，導致合成效率低。首先，環(huán)化必須在高稀釋溶液中進行，以防止/減少分子間反應引起的低聚化，因為肽環(huán)化是一個熵減的過程，導致溶劑的大量浪費，以及操作與后處理過程的繁瑣。其次，活化的C端羧酸容易發(fā)生差向異構化進而產生一對環(huán)異構體，而差向異構體也可能會在堿性條件下，通過α質子的去質子化，將激活的C端羧酸烯醇化而產生，因此液相合成對純化過程要求非常高，導致合成產量降低。最后，在有機溶劑中，一些完全保護的線性肽前體的溶解度很差，會阻止其發(fā)生環(huán)化反應。因此固相多肽合成(SPPS)方法更有競爭力。