[發(fā)明專利]一種XNA分子鉗-多重?zé)晒釶CR法基因突變檢測方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210854682.7
• 申請(qǐng)日: 2022-07-18
• 公開（公告）號(hào): CN115198006A
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建平;周濤;高智勇;何奕輝;張愛國
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京帝基生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858
• 代理公司: 南京蘇博知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32411
• 代理人: 章雅琴

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種XNA分子鉗?多重?zé)晒釶CR法基因突變檢測方法；包括制備待測樣品；提取所述待測樣品中的DNA和RNA，并將所述RNA逆轉(zhuǎn)處理，得到cRNA，再將所述cRNA和所述DNA混合后進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)散，得到熒光樣品；通過熒光PCR擴(kuò)增儀檢測所述熒光樣品，并顯示所述熒光樣品的ct值判定檢測結(jié)果，該方法引入多重?zé)晒釶CR擴(kuò)散技術(shù)，通過采用特異性引物和探針技術(shù)，三色熒光通道檢測模式，建立了實(shí)時(shí)PCR體系，可以同時(shí)檢測多種融合基因和多種突變基因，具備特異性好，準(zhǔn)確率高，快速廉價(jià)，解決現(xiàn)有試劑盒對(duì)基因突變狀態(tài)進(jìn)行檢測耗時(shí)長的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種XNA分子鉗-多重?zé)晒釶CR法基因突變檢測方法。

背景技術(shù)

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，其中80～85％的肺癌為非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌患者中存在多種基因突變類型，其中EGFR、HER2、KRAS、BRAF基因突變頻率分別約為10～50％、1～4％、5～25％、1～2％，ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3基因融合發(fā)生頻率分別約為3～7％、1％、1％、0.12％、0.02％、0.08％，MET外顯子14跳躍基因突變發(fā)生頻率約為1％。大量臨床研究表明，驅(qū)動(dòng)基因突變狀態(tài)是靶向藥物治療的重要療效預(yù)測因子，在進(jìn)行靶向治療前需要對(duì)基因突變狀態(tài)進(jìn)行檢測，并強(qiáng)烈建議進(jìn)行更廣泛的有效基因的狀態(tài)檢測，因此，對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的多基因突變聯(lián)合檢測可為患者提供更精準(zhǔn)的治療。

XNA分子鉗是一種新型的核酸分子低聚體，與靶DNA序列雜交，可作為實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)中的分子鉗，XNA分子鉗檢測可以使用液體活檢和FFPE樣本產(chǎn)生高靈敏度的結(jié)果。

這些基因突變或融合狀態(tài)與靶向藥物的療效相關(guān)，然而，目前大多數(shù)試劑盒每次只能檢測一種或幾種基因突變，檢測通量低，耗時(shí)長，對(duì)樣本需求量大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種XNA分子鉗-多重?zé)晒釶CR法基因突變檢測方法，解決現(xiàn)有試劑盒對(duì)基因突變狀態(tài)進(jìn)行檢測耗時(shí)長的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種XNA分子鉗-多重?zé)晒釶CR法基因突變檢測方法：

制備待測樣品；

提取所述待測樣品中的DNA和RNA，并將所述RNA逆轉(zhuǎn)處理，得到cRNA，再將所述cRNA和所述DNA混合后進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)散，得到熒光樣品；

通過熒光PCR擴(kuò)增儀檢測所述熒光樣品，并顯示所述熒光樣品的ct值判定檢測結(jié)果。

其中，所述制備待測樣品的具體方式：

將各個(gè)來源于無肺病病史健康人群唾液與糞便樣本均接種于培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)20-40h；

分別取各個(gè)所述培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液4ml進(jìn)行離心，5500rpm，10min，離心后的菌體用pH為6.8的無菌生理鹽水洗滌，洗滌后再次進(jìn)行離心，5500rpm，10min，得到無菌純水懸浮菌體；

將400uL的所述無菌純水懸浮菌體，沸水浴10min，10000rpm離心15min，收集上清液。

其中，提取所述待測樣品中的DNA和RNA，并將所述RNA逆轉(zhuǎn)處理，得到cRNA，再將所述cRNA和所述DNA混合后進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)散，得到熒光樣品的具體方式：

提取所述待測樣品中的DNA和RNA，往提取到的所述RNA加熱入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，所述RNA與所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中的逆轉(zhuǎn)錄酶混合，得到cRNA；

將所述DNA和所述cRNA分別與混合酶混合，并對(duì)混合的所述DNA和所述cRNA進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)散，得到所述熒光樣品。