[發(fā)明專利]一種基于suPAR/KL-6免疫層析試劑盒及其制備方法和應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2022-07-19
• 公開（公告）號: CN115616220A
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫彧峰;關(guān)恒;張金玲;丁書博;林琳;牛公正
• 申請（專利權(quán)）人: 長春恒曉生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 北京中政聯(lián)科專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11489
• 代理人: 王玉玨

1.一種基于suPAR/KL-6免疫層析試劑盒，其特征在于，包括免疫層析檢測卡，樣品液和suPAR/KL-6質(zhì)控品，所述suPAR/KL-6質(zhì)控品包括凍干2-4ng/ml suPAR蛋白和200-400U/mlKL-6蛋白和0.5-1.0ml蛋白稀釋液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于suPAR/KL-6免疫層析試劑盒，其特征在于：所述免疫層析試紙條包括PVC底板以及PVC底板上順序連接固定Fusion5、硝酸纖維素膜和吸水紙，F(xiàn)usion5用于吸附suPAR抗體-微球，KL-6抗體-微球和IgG-微球；硝酸纖維素膜設(shè)有固定suPAR抗體形成檢測線1(T1線)，固定KL-6抗體形成檢測線2(T2線)和固定抗IgG抗體形成質(zhì)控線(C線)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于suPAR/KL-6免疫層析試劑盒，其特征在于：所述的微球為金標(biāo)微球、彩色微球、熒光微球、磁性微球或上轉(zhuǎn)換發(fā)光微球中的一種或者多種；所述微球表面修飾官能團為氨基、羧基或羥基中的一種，所述微球直徑范圍是100-300nm。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的基于suPAR/KL-6免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、制備suPAR抗體-熒光微球；

S2、制備KL-6抗體-熒光微球；

S3、制備IgG-熒光微球；

S4、噴涂Fusion5和硝酸纖維素膜；

S5、組裝免疫層析檢測卡；

S6、制備樣品液和suPAR/KL-6質(zhì)控品，步驟如下：

A、樣品液：20mMTris，pH7.5，150mMNaCl，0.5％BSA，2.0％Tween-20，0.05％Proclin300；

B、制備suPAR/KL-6質(zhì)控品，用PBS，pH7.4，1％Trehaloes制備400ng/ml suPAR重組蛋白和40000U/ml KL-6重組蛋白混合液，取10ul蛋白混合液到凍干瓶中，放入冷凍干燥機，離心，冷凍干燥，取出凍干瓶，密封后，2-8℃保存；

C、制備蛋白稀釋液：20mMNaHPO₄，pH7.0，1.0mMEDTA，1.0mMDTT，150mMNaCl，10％BSA，2.0％Trehalose，0.2％PVP，0.01％NP-40，0.05％Proclin300；使用前，將密封凍干瓶打開，加入1.0ml蛋白稀釋液，充分溶解蛋白，制備成4.0ng/ml suPAR蛋白和400U/ml KL-6蛋白質(zhì)控品，2-8℃保存，備用。

5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于suPAR/KL-6免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于：

所述步驟S1選用銪螯合物(Europium Chelate)熒光標(biāo)記羧基修飾微粒，微球直徑為100nm-300nm；本發(fā)明實施例中，把兔suPAR抗體,購于BioVisionInc，偶聯(lián)到銪螯合物熒光標(biāo)記羧基修飾微球上，微球直徑為200nm，步驟如下：

A、10mg/ml銪螯合物熒光標(biāo)記羧基修飾微球，取0.1ml加入1.5ml離心管中，離心，15000rpm，15分鐘，去除上清液；

B、再加1.2ml20mMMES緩沖液，pH6.0，到離心管中懸浮微球，離心，15000rpm，15分鐘，去除上清液；

C、加0.2ml上述MES緩沖液含5mMEDC和20mMSulfo-NHS到離心管中，混均，室溫，反應(yīng)30分鐘；

D、再加1.2ml上述MES緩沖液到離心管中，離心，15000rpm，15分鐘，去除上清液；

E、加0.2mlpH7.0PBS含35ug兔suPAR抗體到上述離心管中，室溫，反應(yīng)2小時；

F、加40ul100mMTris，pH7.4到離心管中，室溫，反應(yīng)60分鐘；

G、加1.2mlNaHPO₄緩沖液，20mMNaHPO₄，pH7.0，0.2％BSA，0.01％Tween-20到離心管中；

H、離心，15000rpm，15分鐘，去除上清液；

I、用上述NaHPO₄緩沖液懸浮suPAR抗體-熒光微球，2-8℃儲存，備用。