[發明專利]一種高效建立昆蟲細胞系的方法

在審

• 申請號: 202210849910.1
• 申請日: 2022-07-19
• 公開（公告）號: CN115044559A
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 張欣;馬琛婧;李嫻;丁偉鋒;陳航;馮穎
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院高原林業研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/866;C12N15/54
• 代理公司: 佛山知正知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 44483
• 代理人: 熊林瑞

本發明涉及生物技術領域，且公開了一種高效建立昆蟲細胞系的方法，包括以下步驟：S1、用酒精溶液對昆蟲蟲體進行滅菌處理，用無菌水對滅菌后的昆蟲蟲體進行清洗，用濾紙吸去水份；S2、在顯微鏡下挑取S1的昆蟲的組織放入PBS溶液進行常規清洗；S3、將S2中的清洗昆蟲組織轉入胰酶溶液中，在離心管中將昆蟲剪碎，消化處理，得昆蟲細胞懸液。該一種高效建立昆蟲細胞系的方法，建立了多種昆蟲細胞系，尤其使難于培養的蜚蠊目及直翅目昆蟲細胞也得到順利培養，并均能在體外穩定生長并建系成功，大大減短了細胞系建系時間，并且讓細胞系度過了傳代的危機，傳代超過50代，能穩定增殖，成為無限細胞系。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體為一種高效建立昆蟲細胞系的方法。

背景技術

端粒酶具有合成端粒DNA以維持端粒長度的能力，使細胞能夠無限分裂。它在維持細胞活力和自我更新方面發揮著關鍵作用，端粒酶由三部分組成：端粒酶RNA(TR)、端粒酶相關蛋白(TEP)、端粒酶逆轉錄酶(TERT)和端粒酶催化亞基(TCS)。端粒酶逆轉錄酶TERT在端粒酶的激活中起關鍵作用。在正常細胞中很難檢測到端粒酶的活性，但在大多數腫瘤細胞和永生細胞系中都發現了端粒酶的表達，提示端粒酶在癌癥發生和細胞永生化中起重要作用。TERT在細胞培養物(包括人乳腺上皮細胞、小鼠細胞)中的穩定過表達也導致特定的轉錄反應。人類端粒酶逆轉錄酶hTERT已被鑒定為參與端粒延長的催化酶。因此，將hTERT基因導入原代培養細胞可成為克服細胞培養困難、延長細胞壽命的方法，也是獲得稀有組織細胞系的辦法之一，然而此應該在關于昆蟲細胞的研究很少。昆蟲細胞系的建立具有挑戰性且耗時，許多昆蟲細胞需要長期的原代培養，通常無法通過傳代培養的早期階段而無法建系成功，并且傳統的組織細胞培養方法已被證明是低效的。鑒于引入hTERT基因的方法已被證明可以使某些動物細胞永生化，因此將其引入昆蟲細胞可能是克服昆蟲細胞體外永生化困難、幫助其度過停滯期的一種方法，為此，我們提出一種高效建立昆蟲細胞系的方法。

發明內容

為了彌補現有技術的不足，本發明提供如下技術方案：一種高效建立昆蟲細胞系的方法，包括以下步驟：

S1、用酒精溶液對昆蟲蟲體進行滅菌處理，用無菌水對滅菌后的昆蟲蟲體進行清洗，用濾紙吸去水份；

S2、在顯微鏡下挑取S1的昆蟲的組織放入PBS溶液進行常規清洗；

S3、將S2中的清洗昆蟲組織轉入胰酶溶液中，在離心管中將昆蟲剪碎，消化處理，得昆蟲細胞懸液；

S4、將S3的細胞懸液吸入培養瓶中，并加入培養基補充；

S5、將S4裝有細胞懸液及培養基的培養瓶置于培養箱中，密閉無光照培養至細胞增殖并生長至鋪滿甁底；

S6、將S5鋪滿甁底的原代細胞，以MOI5-10的濃度加入重組桿狀病毒AcMNPV-hTERT進行浸染；

S7、將S6生長穩定后的細胞進行常規懸浮并混勻后，按照比例分瓶，并加入新鮮培養基補充，繼續在密閉無光照培養條件下培養至細胞增殖再分瓶，如此傳代培養，建立昆蟲細胞系。

優選的，所述S1中酒精溶液的質量濃度為65～80％，昆蟲蟲體滅菌處理時間為1-5min，昆蟲蟲體清洗2-4次。

優選的，所述S3中胰酶溶液質量濃度為0.10-0.25％，離心管的容積為：1.5-2ml，昆蟲剪碎至體積為0.5-1m³，消化處理時間為：5-10min。

優選的，所述S4中培養瓶為12.5-25m²的培養瓶，每個培養瓶細胞懸液裝入量為0.5-1ml，培養基補充至4-5ml。

優選的，所述S5中培養箱溫度為25-28℃。