[發(fā)明專利]一種高效建立昆蟲細(xì)胞系的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210849910.1
• 申請(qǐng)日: 2022-07-19
• 公開（公告）號(hào): CN115044559A
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張欣;馬琛婧;李嫻;丁偉鋒;陳航;馮穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/866;C12N15/54
• 代理公司: 佛山知正知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44483
• 代理人: 熊林瑞

1.一種高效建立昆蟲細(xì)胞系的方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1、用酒精溶液對(duì)昆蟲蟲體進(jìn)行滅菌處理，用無(wú)菌水對(duì)滅菌后的昆蟲蟲體進(jìn)行清洗，用濾紙吸去水份；

S2、在顯微鏡下挑取S1的昆蟲的組織放入PBS溶液進(jìn)行常規(guī)清洗；

S3、將S2中的清洗昆蟲組織轉(zhuǎn)入胰酶溶液中，在離心管中將昆蟲剪碎，消化處理，得昆蟲細(xì)胞懸液；

S4、將S3的細(xì)胞懸液吸入培養(yǎng)瓶中，并加入培養(yǎng)基補(bǔ)充；

S5、將S4裝有細(xì)胞懸液及培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中，密閉無(wú)光照培養(yǎng)至細(xì)胞增殖并生長(zhǎng)至鋪滿甁底；

S6、將S5鋪滿甁底的原代細(xì)胞，以MOI5-10的濃度加入重組桿狀病毒AcMNPV-hTERT進(jìn)行浸染；

S7、將S6生長(zhǎng)穩(wěn)定后的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)懸浮并混勻后，按照比例分瓶，并加入新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充，繼續(xù)在密閉無(wú)光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至細(xì)胞增殖再分瓶，如此傳代培養(yǎng)，建立昆蟲細(xì)胞系。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效建立昆蟲細(xì)胞系的方法，其特征在于：所述S1中酒精溶液的質(zhì)量濃度為65～80％，昆蟲蟲體滅菌處理時(shí)間為1-5min，昆蟲蟲體清洗2-4次。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效建立昆蟲細(xì)胞系的方法，其特征在于：所述S3中胰酶溶液質(zhì)量濃度為0.10-0.25％，離心管的容積為：1.5-2ml，昆蟲剪碎至體積為0.5-1m³，消化處理時(shí)間為：5-10min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效建立昆蟲細(xì)胞系的方法，其特征在于：所述S4中培養(yǎng)瓶為12.5-25m²的培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶細(xì)胞懸液裝入量為0.5-1ml，培養(yǎng)基補(bǔ)充至4-5ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效建立昆蟲細(xì)胞系的方法，其特征在于：所述S5中培養(yǎng)箱溫度為25-28℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效建立昆蟲細(xì)胞系的方法，其特征在于：所述重組桿狀病毒AcMNPV-hTERT使用來(lái)自Sangon Biotech的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建，并使用P2代病毒原液為測(cè)試，hTERT基因(GenBank：NM_198253)由Sangon Biotech合成。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效建立昆蟲細(xì)胞系的方法，其特征在于：所述S6的分瓶比例為2:1，加入培養(yǎng)基補(bǔ)充至5ml，傳代培養(yǎng)至50代。