[發明專利]一種擴增小鼠成體肺干細胞的培養基及培養方法

在審

• 申請號: 202210837863.9
• 申請日: 2022-07-16
• 公開（公告）號: CN115896002A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 黃鵬羽;張兵芳
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院生物醫學工程研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 魏志恒

1.一種擴增小鼠成體肺干細胞的培養基，其特征在于，包括以下成分：表皮生長因子5-20ng/mL，纖維生長因子5-20ng/mL，人胰島素生長因子50-100μg/mL，谷氨酰胺2-3mM，谷胱甘肽50-80μg/mL，Y-27632?5-10μM，CHIR99021?1-2μM，抗壞血酸1-2mM，超氧化物歧化酶375-500U/mL，L-脯氨酸100-150μg/mL，L-鳥氨酸100-200μg/mL，生物素125-200μg/mL，吡哌酸100-150μg/mL，α-生育酚100-200μg/mL，DL-α生育酚醋酸酯100-200μg/mL，醋酸視黃醇20-45μg/mL，油酸50-75μg/mL，亞油酸0.5-2mg/mL，亞麻酸0.5-2mg/mL，人轉鐵蛋白250-500μg/mL，皮質酮2-4μg/mL，黃體酮0.63-1.4μg/mL，鹽酸腐胺900-2000μg/mL，胎牛白蛋白250-350mg/mL，乙醇胺0.05-0.15μL/mL和三碘甲狀腺原氨酸100-180ng/mL。

2.根據權利要求1所述的擴增小鼠成體肺干細胞的培養基，其特征在于，包括以下成分：表皮生長因子5ng/mL，纖維生長因子5ng/mL，人胰島素生長因子50μg/mL，谷氨酰胺2mM，谷胱甘肽50μg/mL，Y-27632?5μM，CHIR99021?1μM，抗壞血酸1mM，超氧化物歧化酶375U/mL，L-脯氨酸100μg/mL，L-鳥氨酸100μg/mL，生物素125μg/mL，吡哌酸100μg/mL，α-生育酚100μg/mL，DL-α生育酚醋酸酯100μg/mL，醋酸視黃醇20μg/mL，油酸50μg/mL，亞油酸0.5mg/mL，亞麻酸0.5mg/mL，人轉鐵蛋白250μg/mL，皮質酮2μg/mL，黃體酮0.63μg/mL，鹽酸腐胺900μg/mL，胎牛白蛋白250mg/mL，乙醇胺0.05μL/mL和三碘甲狀腺原氨酸100ng/mL。

3.根據權利要求1或2所述的擴增小鼠成體肺干細胞的培養基，其特征在于，以DMEM/F12作為溶劑。

4.一種權利要求1-3任一所述的擴增小鼠成體肺干細胞的培養基的配制方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)分別將表皮生長因子、纖維生長因子、谷氨酰胺、谷胱甘肽、抗壞血酸、超氧化物歧化酶、L-脯氨酸、L-鳥氨酸、生物素、吡哌酸、人轉鐵蛋白、鹽酸腐胺和胎牛白蛋白溶于DMEM/F12配制成母液；

分別將Y-27632、CHIR99021、α-生育酚、DL-α生育酚醋酸酯、醋酸視黃醇、油酸、亞油酸、亞麻酸、皮質酮、黃體酮和三碘甲狀腺原氨酸溶于DMSO配制成母液；

將人胰島素生長因子溶解于0.005MHCl配制成母液；

(2)按照培養基的使用終濃度將步驟(1)各母液添加到DMEM/F12中，最后加入乙醇胺使其終濃度為0.05-0.15μL/mL。

5.一種小鼠成體肺干細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)用含10％FBS的DMEM/F12培養基在膠原包被的培養皿中培養原代肺細胞，使肺干細胞之外的其他類型的細胞貼壁；

(2)收集未貼壁的肺干細胞，用權利要求1-3任一所述的培養基進行培養，得小鼠成體肺干細胞。

6.根據權利要求5所述的小鼠成體肺干細胞的培養方法，其特征在于，步驟(2)培養過程中每間隔一天進行半量換液。

7.一種小鼠成體肺干細胞，其特征在于，利用權利要求1-3任一所述培養基或者權利要求5或6所述培養方法培養所得的細胞。

8.一種權利要求1所述培養基在制備細胞中的應用。

9.一種權利要求1所述培養基在制備擴增肺干細胞制品中的應用。

10.一種權利要求7所述小鼠成體肺干細胞非診斷治療目的的應用，其特征在于，所述應用為以下任意一種：

A:體外研究成體肺干細胞增殖、分化、死亡調控機制；

B：肺干細胞治療效能評價；

C：功能性肺類器官構建；

D：呼吸疾病藥物開發、篩選、藥理效價評估。