[發明專利]H5和H9亞型禽流感病毒雙重納米PCR檢測的引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202210837159.3
• 申請日: 2022-07-15
• 公開（公告）號: CN116083641A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 謝芝勛;李孟;李丹;謝麗基;羅思思;張民秀;李小鳳;阮志華;謝志勤
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南寧頌博遠信知識產權代理事務所(普通合伙) 45141
• 代理人: 蘭亞君

本發明公開了一種通過雙重納米PCR檢測H5和H9亞型禽流感病毒的引物組，包括引物H5?F、引物H5?R、引物H9?F、引物H9?R，其特征在于：所述引物H5?F的序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述引物H5?R的序列如SEQ?IDNO.2所示，所述引物H9?F的序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述引物H9?R的序列如SEQ?ID?NO.4所示。本發明方法具有特異性強，檢測靈敏度高，快速簡便及易于操作等優點，十分適于在基層單位應用推廣，為H5與H9亞型AIV的監測及其防控提供技術支撐。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，特別涉及H5和H9亞型禽流感病毒雙重納米PCR檢測的引物組、試劑盒及方法。

背景技術

禽流感(avian?influenza，AI)是由正粘病毒科、流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類(家禽或野禽，以及部分哺乳動物)傳染病。禽流感病毒血清亞型眾多，抗原變異性強，宿主范圍廣泛，亞型間無交叉保護性，使得禽流感頻繁暴發。尤其是高致病性禽流感，是OIE規定的法定報告A類動物疫病。禽流感病毒(Avian?influenza?virus,AIV)在流行的過程中不斷變異，跨越宿主屏障，H5亞型禽流感病毒屢次暴發疫情，給養禽業和人類的生命安全帶來巨大的威脅。H5N1亞型AIV不斷發生重組與突變，產生不同亞型的H5Nx病毒，包括N2、N3、N5、N6、N8和N9。H5Nx亞型AIV(H5N1、H5N6和H5N8?等亞型)HA基因形成了多個進化分支。H9亞型禽流感病毒并未被規定為高致病性禽流感，往往被人們所忽視，從而造成了以H9亞型為主的低致病性禽流感的大范圍流行和對養禽業產生持續危害。此外，有研究顯示H9N2亞型禽流感病毒在全世界范圍內廣泛傳播的同時也以重配的方式產生新型禽流感病毒。

目前國內外檢測禽流感病毒最常用和經典的方法是雞胚病毒分離，并且是國際貿易中指定的檢測方法，但該方法技術要求高、耗費時間長，在疫情暴發時不利于病原的快速診斷和疫情控制。目前市場的禽流感病毒檢測手段多以單重RT-PCR為主，不能區分具體亞型，但在平時疫情檢測和實施撲滅措施時對這些病毒亞型進行快速檢測和定型非常重要。納米PCR技術是在PCR?反應的buffer中添加一定量的粒徑為1～100nm的納米金屬顆粒，從而形成納米流體，納米流體具有極高的導熱性，比普通流體要高得多，因此在添加了納米金屬顆粒的PCR熱循環中，PCR反應能夠更快地達到目標溫度，從而縮短了在非目標溫度停留的時間，不僅減少了非特異擴增，也提高了反應的特異性。目前，H5和H9亞型禽流感混合感染十分常見且在臨床癥狀上難以區分，H9N2亞型AIV還為感染人的H5N1和H5N6等亞型AIV提供內部基因，使得對H5和H9亞型禽流感的鑒別診斷越來越重要和迫切。納米PCR技術檢測動物病原檢測中已經有多篇報道，而雙重納米PCR(nano-dPCR)技術反應同時檢測和鑒別H5和H9亞型AIV的核酸檢測技術尚未見有報道。

發明內容

本發明的目的在于提供H5和H9亞型禽流感病毒雙重納米PCR檢測的引物組、試劑盒及方法。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案如下：

本發明提供一種可通過雙重納米PCR檢測H5和H9亞型禽流感病毒的引物組，包括引物H5-F、引物H5-R、引物H9-F、引物H9-R。引物H5-F的序列如SEQ?ID?NO.1所示，引物H5-R的序列如SEQ?ID?NO.2所示，引物H9-F?的序列如SEQ?ID?NO.3所示，引物H9-R的序列如SEQID?NO.4所示。

含有上述引物組的試劑或試劑盒屬于本發明的保護范圍。

本發明提供了上述引物組在通過雙重納米PCR檢測H5和H9亞型禽流感病毒的方法。

所述的方法，進一步包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的cDNA；

(2)建立雙重納米PCR反應體系，利用上述引物組進行雙重納米PCR?反應；