[發明專利]一種定量檢測KRAS基因突變的引物探針組合及其應用

在審

• 申請號: 202210835824.5
• 申請日: 2022-07-15
• 公開（公告）號: CN116042818A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 陳雯雯;王紀東;陳永欣
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 陳小龍

本發明公開了一種定量檢測KRAS基因突變的引物探針組合及其應用。所述引物探針組合包括定量檢測KRAS基因突變的引物和探針，所述探針包括KRAS基因的野生型探針、KRAS基因的G12D突變位點、G12S突變位點和G13D突變位點的突變探針。本發明針對KRAS基因設計引物、野生型探針及突變探針，協同配合并能夠基于數字PCR同時對KRAS基因的3種熱點突變(p.G12D、p.G12S和p.G13D)進行分型與定量檢測，具備良好特異性和靈敏度，且檢測過程操作簡便、成本低。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，涉及一種定量檢測KRAS基因突變的引物探針組合及其應用。

背景技術

KRAS基因在EGFR信號傳導通路下游RAS-RAF-MEK-ERK途徑和PI3K-AKT-mTOR途徑中起到分子關卡的作用，與腫瘤的發生發展息息相關。KRAS基因的突變會直接影響針對EGFR基因的抗腫瘤藥物的療效，進行癌癥患者基因突變狀態的檢測與分析，對臨床用藥及治療方案指導具有重要意義。

目前檢測KRAS基因突變的方法主要有2種：熒光定量PCR法和測序法。直接測序法存在檢測靈敏度不足、操作繁瑣、無法進行多突變同時檢測等缺點。大部分商用的試劑盒依賴于ARMS-qPCR技術，難以進行突變的定量分析，如CN106636442A公開了一種人類腫瘤基因變異聯合檢測試劑盒，包括以下部分：KRAS基因引物組、HiFi酶、PCR反應液、消化酶、連接酶、連接緩沖液、連接接頭、熒光探針、QPCR反應的Taq酶、QPCR引物和QPCR反應液，能同時檢測人類腫瘤的多種驅動基因的突變位點。CN110684849A公開了一種基于ddPCR檢測人循環腫瘤細胞KRAS基因突變的引物探針組、試劑盒及方法。其中，引物探針組包括檢測KRAS基因2號外顯子上第12號、第13號密碼子突變位點的引物及探針，其中，各突變位點分別為：G12D、G12V、G12A、G12C、G12S、G12R以及G13D。

綜上所述，提供一種定量檢測KRAS基因中多個突變熱點試劑盒，對于腫瘤基因檢測領域具有重要意義。

發明內容

針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供一種定量檢測KRAS基因突變的引物探針組合及其應用，設計特定序列的引物探針組合，協同配合，可基于數字PCR，能夠同時對KRAS基因的3種熱點突變(p.G12D、p.G12S和p.G13D)進行分型與定量檢測，具備良好特異性和靈敏度，且操作簡便、成本低。

為達上述目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種定量檢測KRAS基因突變的引物探針組合，其所述引物探針組合包括定量檢測KRAS基因突變的引物和探針，所述探針包括KRAS基因的野生型探針、KRAS基因的G12D突變位點、G12S突變位點和G13D突變位點的突變探針，所述KRAS基因的上游引物的核酸序列包括SEQ?ID?NO.1所示的序列，下游引物的核酸序列包括SEQ?ID?NO.2所示的序列，所述KRAS基因的野生型探針的核酸序列包括SEQ?ID?NO.3所示的序列，所述KRAS基因的G12D突變位點的突變探針的核酸序列包括SEQ?ID?NO.4所示的序列，所述KRAS基因的G12S突變位點的突變探針的核酸序列包括SEQ?ID?NO.5所示的序列，所述KRAS基因的G13D突變位點的突變探針的核酸序列包括SEQ?ID?NO.6所示的序列。

本發明中，針對KRAS基因設計引物、野生型探針及突變探針，協同配合并能夠基于數字PCR同時對KRAS基因的3種熱點突變(p.G12D、p.G12S和p.G13D)進行分型與定量檢測，具備良好特異性和靈敏度。

SEQ?ID?NO.1：5’-AAGGCCTGCTGAAAATGACT-3’。

SEQ?ID?NO.2：5’-GTCCTGCACCAGTAATATGC-3’。

SEQ?ID?NO.3：5’-TGGAGCTGGTGGCGT-3’。