[發明專利]一株枯草芽孢桿菌及其應用

在審

• 申請號: 202210834070.1
• 申請日: 2022-07-14
• 公開（公告）號: CN116004417A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 柏文琴;鄭宏臣;譚明;鄭雯;付曉平;趙興亞
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/10;C12P19/56;C12P33/20;C12R1/125
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽石文

本發明公開了一株枯草芽孢桿菌在糖基化修飾中的應用。具體而言，本發明從環境中篩選得到的一株枯草芽孢桿菌，以及使用該枯草芽孢桿菌進行糖基化修飾。該菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.19322，本發明以甜菊糖和萊胞迪苷A為底物，添加該枯草芽孢桿菌發酵上清液經12?h轉化反應后，生成萊胞迪苷E，產率最高達78.9%；經過30h轉化反應后，生成萊胞迪苷D，產率最高達39.7%。

技術領域

本發明涉及一株枯草芽孢桿菌糖基轉移酶生產菌株的篩選及其應用，屬于微生物領域和生物工程領域。

背景技術

糖基化是天然產物生物合成過程中一種重要的后期修飾反應，多數有活性的天然產物都以糖苷的形式存在。近年來以天然產物為底物，利用不同來源的糖基轉移酶合成糖苷類化合物的研究有很多，例如利用糖基轉移酶改善天然產物的成藥性、對一些天然產物進行修飾生產甜味劑等代糖產品等。隨著糖尿病等在全球的高發現象，市場上也涌現出多種代糖產品，其中甜菊糖苷類化合物因其高倍的甜味在市場上脫穎而出，甜菊糖苷類化合物種類繁多，應用中最多的目前有包括：甜菊糖，萊胞迪苷A、萊胞迪苷D、萊胞迪苷M、萊胞迪苷E、萊胞迪苷C，其中萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷E的甜味約是蔗糖的200-250倍。市場上幾種不同萊鮑迪苷化合物的復配可產生不同的口感的甜味劑被添加到食品和飲料中，其次考慮到生產成本，很多甜菊糖苷類化合物的生產成本居高不下，所以復配不同種類的甜菊糖苷化合物是降低成本的必要方式。

目前，生產甜菊糖苷類化合物的方法多樣化，主要是應用大腸桿菌和酵母表達系統生產糖基轉移酶在體外反應體系合成甜菊糖苷，?其次是應用大腸桿菌或酵母細胞內催化合成甜菊糖苷類化合物。第三種方法是對甜菊糖苷類化合物進行改性處理，常用環糊精葡萄糖基氧化酶等。

但是現存的幾種策略以大腸桿菌表達的糖基轉移體外反應生產的甜菊糖苷類化合物的產量及產率相對較高，但是大腸桿菌作為食品生產菌種存在安全隱患，并且其產生的內毒素去除成本高。其次，甜菊糖苷類化合物的改性通常在糖基化產物不專一，效率較低。

芽胞桿菌屬廣泛分布于土壤環境中，其菌種多樣性為食品、酶制劑、生物醫藥等工業領域提供了豐富的菌株資源，并且大多數芽胞桿菌生長速度快,?產酶容易分泌到胞外且易分離，對營養要求也比較低不會產生毒素，并被美國食品藥品監督管理局批準為食品安全菌株。

因此以芽孢桿菌作為底盤細胞生產甜菊糖苷類衍生物是優良的選擇。

發明內容

本發明所解決的技術問題是提供一種糖基轉移酶生產菌株及其應用。

本發明首先提供一種糖基轉移酶生產菌株，其分類命名為枯草芽孢桿菌SH-12（Bacillu?sp.），于2020年1月9日保藏于中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院(中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC?No.?19322。該糖基酶生產菌株是從云南輪馬熱泉下游的淤泥土壤中經平板菌落特征初篩，采用一級發酵逐一搖瓶培養，經酶活測定，比較糖基轉酶酶活而得到。以該菌為出發菌株，經種子培養和液體深層發酵生產糖基轉移酶，并以發酵所得粗酶液為催化劑可以生產萊胞迪苷D和萊胞迪苷E。

本發明由此提供一種制備糖基轉移酶的方法，其特征在于，利用述的枯草芽孢桿菌制備的得到。具體實施方式中，其通過發酵得到發酵液，離心取上清液即可。優選地，進一步通過純化獲得更純的糖基轉移酶。

進而，本發明還提供一種制備萊鮑迪苷E的方法，其特征在于，以甜菊糖和萊鮑迪苷A混合物（例如是由甜菊葉提取制備得到的）為底物，以及UDP、蔗糖合酶、蔗糖和來源于本發明菌株的糖基轉移酶構成反應體系，反應生成萊鮑迪苷E；或者以甜菊糖和萊鮑迪苷A混合物為底物，以及UDPG和來源于本發明菌株的糖基轉移酶構成反應體系，反應生成萊鮑迪苷E。

優選地，反應pH值為6-10，更優選為7-9。

優選地，反應溫度為25-45℃，更優選為30-40℃。