[發(fā)明專利]一種促進(jìn)原代人表皮黑色素細(xì)胞貼壁的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210828168.6
• 申請(qǐng)日: 2022-07-13
• 公開（公告）號(hào): CN116064369A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何锎釙;檀東安;黃昶灝;李雨澤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建省海西細(xì)胞生物工程有限公司;北京康曦健康醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N15/113
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 林文弘;蔡學(xué)俊

1.一種促進(jìn)原代人表皮黑色素細(xì)胞貼壁的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）取材：用表皮移植治療儀在患者供皮區(qū)域用多孔吸盤以壓力30kpa~60kpa、溫度38~45℃條件提取表皮組織，放入含有0.1~1mM?N-乙酰半胱氨酸和0.1~1mM葡萄糖的磷酸鹽緩沖液中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室；

2）分離：用無(wú)菌生理鹽水將步驟1）得到的表皮組織漂洗7次以上，再在無(wú)菌條件下切割至1平方毫米大小，而后加入10~200ug/mL的乙二胺四乙酸二鈉或0.01~0.25%wt.%的胰蛋白酶溶液在37℃培養(yǎng)箱恒溫消化10~30min，再加入胰蛋白酶抑制劑終止消化，之后將消化混合液以500g的速度離心5min，棄去上清，收集細(xì)胞沉淀備用；

3）包被培養(yǎng)瓶：以5~10ug/mL的纖維蛋白溶液或1~10ug/mL的I型膠原蛋白溶液包被塑料培養(yǎng)瓶，在2~8℃條件下過(guò)夜處理；

4）接種培養(yǎng)：將步驟2）所得細(xì)胞沉淀用黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，按1×10⁴~10×10⁴個(gè)/cm²的密度接種于步驟3）得到的包被后的培養(yǎng)瓶中，隨后將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

5）換液：步驟4）的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)至第3天進(jìn)行首次更換黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基，之后每隔3天進(jìn)行全量換液；

6）傳代：待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度50~80%時(shí)，用生理鹽水洗滌細(xì)胞2次，加入0.05wt.%胰蛋白酶溶液在37℃培養(yǎng)箱恒溫消化3~5min，用黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行消化終止，收集消化細(xì)胞，按1×10⁴個(gè)/cm2的密度進(jìn)行傳代種瓶，在37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

7）鑒定：利用RT-PCR檢測(cè)酪氨酸相關(guān)蛋白酶核酸含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)原代人表皮黑色素細(xì)胞貼壁的方法，其特征在于：所述步驟1）中，用表皮移植治療儀在患者供皮區(qū)域用多孔吸盤以壓力45kpa~50kpa、溫度38~45℃條件提取表皮組織，放入含有0.5mM?N-乙酰半胱氨酸和0.5mM葡萄糖的磷酸鹽緩沖液中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)原代人表皮黑色素細(xì)胞貼壁的方法，其特征在于：所述步驟2）中，用無(wú)菌生理鹽水將步驟1）得到的表皮組織漂洗7~10次，再在無(wú)菌條件下切割至1平方毫米大小，而后加入100ug/mL的乙二胺四乙酸二鈉或0.05%wt.%的胰蛋白酶在37℃培養(yǎng)箱恒溫中孵育30min，再加入0.05%wt.%的胰蛋白酶溶液在37℃培養(yǎng)箱恒溫消化30min，再加入胰蛋白酶抑制劑終止消化，之后將消化混合液以500g的速度離心5min，棄去上清，收集細(xì)胞沉淀備用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)原代人表皮黑色素細(xì)胞貼壁的方法，其特征在于：所述步驟3）中，以5ug/mL的纖維蛋白溶液或5ug/mL的I型膠原蛋白溶液包被塑料培養(yǎng)瓶，在2~8℃條件下過(guò)夜處理。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)原代人表皮黑色素細(xì)胞貼壁的方法，其特征在于：所述步驟4）中，將步驟2）所得細(xì)胞沉淀用黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，按5×10⁴個(gè)/cm²的密度接種于步驟3）得到的包被后的培養(yǎng)瓶中，隨后將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)原代人表皮黑色素細(xì)胞貼壁的方法，其特征在于：所述的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基為在CnT-40培養(yǎng)基中加入1~100nM的microRNA-34a和100ug/mL的遺傳霉素G418，microRNA-34a的序列如下：5’-ggccagctgtgagtgtttctttggcagtgtcttagctggttgttgtgagcaatagtaaggaagcaatcagcaagtatactgccctagaagtgctgcacgttgtggggccc-3’。