[發明專利]一種促進原代人表皮黑色素細胞貼壁的方法

在審

• 申請號: 202210828168.6
• 申請日: 2022-07-13
• 公開（公告）號: CN116064369A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 何锎釙;檀東安;黃昶灝;李雨澤
• 申請（專利權）人: 福建省海西細胞生物工程有限公司;北京康曦健康醫學研究院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N15/113
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 林文弘;蔡學俊

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種促進原代人表皮黑色素細胞貼壁的方法，所述方法包括取材、分離、包被培養瓶、接種培養、換液、傳代和鑒定步驟。本發明通過在黑色素細胞培養基中添加miRNA?34a調控細胞的整合素表達，在使用I型膠原或纖連蛋白包被的情況下，可進一步加速細胞貼壁時間，提高細胞貼壁能力，克服了從細胞貼壁率低、耗時長的困難，以及提高了低密度細胞增殖的效率，高效縮短黑色素細胞的培養周期，以獲得純度更高的黑色素細胞。

技術領域

本發明涉及一種促進原代人表皮黑色素細胞貼壁的方法，屬于細胞培養技術領域。

背景技術

白癜風是一種發病機制不明的皮膚病，每?200?人中就有?1?人受到影響，目前已經提出了幾種潛在的發病機制，包括自身免疫、神經體液因素和自身細胞毒性等，不過白癜風可能是由多種因素引起的，發病部位覆蓋全身，常見于面部、軀干、四肢。白癜風是局部黑色素細胞破壞引起的色素脫失的皮膚病，發病區域為邊界清晰的皮膚白斑，臨床上較常見的以皮膚顏色減退、變白，境界鮮明，無自覺癥狀為特征。

表皮為皮膚的最外層，它覆蓋全身并有保護作用。表皮沒有血管，但有許多微小的神經末梢。表皮按細胞形態可分為5層，由外至內依次為：角質層、透明層、顆粒層、棘細胞層、基底層。黑色素細胞大部分存在于基底層，少部分存在于棘層。當白癜風發病時，基底層的黑色素細胞會受到多種因素影響，出現老化、停止增殖、死亡等，導致病變區黑色素細胞缺失，從而呈現皮膚脫色，發白。

目前白癜風治療方案可分為兩大類，一類為刺激患病區殘余的黑色素細胞，另一類是黑色素細胞的移植，常見的治療方案如下：

1.藥物紫外治療方案：外用皮質類固醇、使用補骨脂素-UVA?的光化學療法和窄帶?UVB。

2.手術治療方案：涉及細胞培養技術的和不涉及細胞培養技術的。

3.不涉及細胞培養的手術治療：全層穿孔移植、抽吸式水皰移植和未培養的黑素細胞-角質形成細胞懸液移植。

4.涉及細胞培養技術的手術治療：純黑色素體外培養懸液移植、黑色素細胞-角質形成細胞體外培養皮片移植。

上述所有治療方案，均涉及黑色素細胞，需要黑色素細胞具備一定的移植數量以及優秀的細胞狀態，通過本發明可以很好的改善所述需求點，提高移植后治療效果。

發明內容

解離法是目前從表皮中獲取黑色素細胞最基礎的方法，然而，皮膚組織多取自受術者耳后、大腿內側、腹部等部位，皮膚大小有限，有限皮膚在組織解離法提取過程中極易造成酶的過度消化，降低細胞的活力，影響后續細胞的生長狀態。本發明基于現有的解離法，建立了一種簡單、高效的促進原代人表皮黑色素細胞貼壁的方法，運用“組織工程技術”對皮膚組織進行分離、純化、培養、擴增、并收獲大量高純度的黑色素細胞，且所得到的自體黑色素細胞不存在排異狀況，可很好的在受術者表皮組織中進行生長，從而達到在白斑區域重新著色的效果。

為解決上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種促進原代人表皮黑色素細胞貼壁的方法，包括以下步驟：

1）取材：用表皮移植治療儀在患者供皮區域用多孔吸盤以壓力30kpa~60kpa、溫度38~45℃條件提取表皮組織，放入含有0.1~1mM?N-乙酰半胱氨酸和0.1~1mM葡萄糖的磷酸鹽緩沖液中，立即帶回實驗室；

2）分離：用無菌生理鹽水將步驟1）得到的表皮組織漂洗7次以上，再在無菌條件下切割至1平方毫米大小，而后加入10~200ug/mL的乙二胺四乙酸二鈉或0.01~0.25%wt.%的胰蛋白酶溶液在37℃培養箱恒溫消化10~30min，再加入胰蛋白酶抑制劑終止消化，之后將消化混合液以500g的速度離心5min，棄去上清，收集細胞沉淀備用；

3）包被培養瓶：以5~10ug/mL的纖維蛋白溶液或或1~10ug/mL的I型膠原蛋白溶液包被塑料培養瓶，在2~8℃條件下過夜處理；