[發(fā)明專利]基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法及其應(yīng)用

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• 申請日: 2022-07-13
• 公開（公告）號: CN115931795A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張紅;苗向敏;賀帆;楚文娟;駱震;胡建東
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 鄭州優(yōu)盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41125
• 代理人: 鄭園

1.基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法，其特征在于，步驟如下：

（1）利用檸檬酸鈉溶液還原氯金酸溶液制備AuNPs溶液；

（2）將發(fā)卡探針H₁溶于醋酸鹽緩沖溶液中，再加入TCEP，所得溶液加至步驟（1）的AuNPs溶液中，室溫孵育，然后分批加入NaCl?溶液，離心去除上清，即得發(fā)卡探針H₁修飾的AuNPs探針，即H₁-AuNPs；

（3）將EDC和NHS的混合液加入到CDs溶液中，室溫攪拌，然后加入發(fā)卡探針H₂，繼續(xù)室溫攪拌，得發(fā)卡探針H₂修飾的CDs，即H₂-CDs；

（4）將適配體AP與輔助探針HP在室溫下雜交獲得最初反應(yīng)液，然后加入待測樣品，室溫孵育后加入步驟（2）的H₁-AuNPs，反應(yīng)一段時間，再加入步驟（3）的H₂-CDs，離心除去反應(yīng)液，所得沉淀經(jīng)稀釋后，進(jìn)行熒光檢測；

（5）將步驟（4）測得的FAM熒光強(qiáng)度和CDs熒光強(qiáng)度的比值代入線性方程F_FAM/F_CDs?=4.43?c?+?0.46，求得c值，即得待測樣品的OTA的濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法，其特征在于：所述步驟（1）AuNPs溶液中AuNPs的直徑小于0.45?μm，AuNPs的濃度為11.5?nM。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟（2）中發(fā)卡探針H₁的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其5’端修飾有巰基、3’端修飾有FAM基團(tuán)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法，其特征在于：所述醋酸鹽緩沖溶液中發(fā)夾探針H₁的濃度為10?μM，醋酸鹽緩沖溶液的pH為5、體積為60μL；TCEP的濃度為20?mM、體積為10?μL；AuNPs溶液的體積為4?mL；孵育的時間為16?h；加入NaCl溶液后NaCl的終濃度為0.1M。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）中發(fā)卡探針H₂的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，其5’端修飾有氨基。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法，其特征在于：所述EDC和NHS的濃度均為100?μM、體積均為100?μL；CDs溶液中的CDs濃度為1?mg/L、體積為5?mL；發(fā)卡探針H₂的濃度為100?μM、體積為20?μL；所得H₂-CDs的濃度為100?μM。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法，其特征在于：所述步驟（4）中適配體AP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；輔助探針HP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法，其特征在于：所述適配體AP和輔助探針HP在最初反應(yīng)液中的濃度均為100?μM；孵育的時間為40?min；加入發(fā)卡探針H₁反應(yīng)的時間為45?min；加入H₂-CDs反應(yīng)的時間為60?min；熒光檢測的激發(fā)光波長為360?nm。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法，其特征在于：所述步驟（5）的線性方程中c的單位為ng/mL。

10.權(quán)利要求1、2或4-9任一項所述的方法在檢測OTA中的應(yīng)用，其特征在于：對于赭曲霉素A檢測的線性范圍為5.0?pg/mL-3.0?ng/mL，檢出限為1.5?pg/mL。