[發(fā)明專利]基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210827487.5
• 申請日: 2022-07-13
• 公開（公告）號: CN115931795A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張紅;苗向敏;賀帆;楚文娟;駱震;胡建東
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 鄭州優(yōu)盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41125
• 代理人: 鄭園

本發(fā)明提供了基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法及其應(yīng)用，利用CDs和FAM作為雙發(fā)射熒光探針結(jié)合CHA信號放大技術(shù)構(gòu)建一種比率型熒光傳感器，最終通過測定FAM熒光強度和CDs熒光強度的比值Fsubgt;FAM/subgt;/Fsubgt;CDs/subgt;實現(xiàn)赭曲霉素A的定量檢測，線性范圍為5.0?pg/mL?3.0?ng/mL，檢出限為1.5?pg/mL。本發(fā)明用于檢測赭曲霉素A的比率型熒光傳感器不僅具有自校準(zhǔn)功能，可消除探針濃度、極性、溫度和激發(fā)強度等多種可變或難以定量的因素的干擾，拓寬響應(yīng)范圍，有效提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，而且整個操作過程無蛋白酶等酶類參與，受外界環(huán)境影響小，靈敏度高而操作條件、操作成本要求低，可實現(xiàn)超痕量OTA的準(zhǔn)確檢測，具有工業(yè)應(yīng)用和推廣的價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

赭曲霉素A(Ochratoxin?A，OTA)是一種由曲霉菌和青霉菌產(chǎn)生的具有免疫毒性、致畸性和致癌作用的真菌毒素，能污染谷物、大米、甘草以及葡萄酒等多種食物，對人類健康的威脅不容小覷。因此，有必要建立一種準(zhǔn)確、靈敏的分析方法用于食品中OTA的檢測。

熒光光譜法由于其簡單、靈敏、便于同時檢測等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于檢測行業(yè)。但是由于目標(biāo)物低豐度、基體效應(yīng)和方法靈敏度的限制，常規(guī)的熒光生物傳感器難以實現(xiàn)對超痕量組分的準(zhǔn)確檢測。因此，采用信號放大技術(shù)提高檢測的靈敏度是突破熒光生物傳感器應(yīng)用瓶頸的一個重要途徑。目前，已報道的無酶參與的信號放大技術(shù)主要包括雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization?chain?reaction,?HCR）、催化發(fā)卡自組裝信號放大技術(shù)（Catalytichairpin?assembly,?CHA）以及DNA步行者等，其中，CHA是一種通過發(fā)卡DNA循環(huán)組裝而建立的無酶信號放大技術(shù)，引發(fā)鏈循環(huán)催化發(fā)卡底物組裝，在每個級聯(lián)反應(yīng)后被釋放出來，用于引發(fā)下一個循環(huán)反應(yīng)。因此，基于CHA信號放大技術(shù)的熒光生物傳感器被廣泛用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)、金屬離子以及生物小分子的檢測中。

盡管信號放大技術(shù)可以提高熒光傳感器的靈敏度，但是復(fù)雜樣品的基體干擾以及假陽性問題仍然限制了熒光傳感器的應(yīng)用，熒光傳感器的準(zhǔn)確性受到限制。如專利“專利號CN?106370638?B”公開一種用于Hg²⁺檢測的比色、熒光雙信號生物傳感器及檢測方法，基于催化發(fā)卡組裝無酶放大技術(shù)構(gòu)建了比色-熒光雙信號生物傳感器，雖然兼具比色法便利和熒光法靈敏度高的優(yōu)點，但是也存在復(fù)雜樣品的基體干擾以及假陽性問題，檢測結(jié)果易出錯。專利“專利號CN?114113264?A”公開一種基于EXOⅢ輔助鏈循環(huán)和CHA反應(yīng)的妥布霉素雙放大檢測方法和應(yīng)用，但該傳感器在誘導(dǎo)CHA反應(yīng)時使用的蛋白酶易受環(huán)境影響，在很大程度上增加了該方法的操作條件要求和成本，同時也對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生不利影響，限制了該方法的應(yīng)用。

同時，目前關(guān)于構(gòu)建生物傳感器實現(xiàn)OTA檢測的研究尚在發(fā)展中，專利“專利號CN109884009?A”公開了一種目標(biāo)物介導(dǎo)的熒光比率型傳感器檢測赭曲霉素A的檢測方法，但其核酸信號微弱，熒光傳感器的靈敏度有限；專利“專利號CN?111424072?A”公開了一種檢測赭曲霉毒素A的電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，但檢測限僅能達到100?ng/mL，難以實現(xiàn)對赭曲霉素A的超痕量檢測。因此，克服上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷，提供一種簡單便捷、快速且高靈敏度的檢測OTA的方法，是目前OTA檢測應(yīng)用中亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有檢測方法檢測OTA時靈敏度、精確度較差及超痕量難以檢測的技術(shù)問題，本發(fā)明提出基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法及其應(yīng)用。

針對上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

基于CHA的比率型熒光傳感器檢測OTA的檢測方法，步驟如下：