[發(fā)明專(zhuān)利]一種構(gòu)建可通過(guò)藥物誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)的模型豬的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210822307.4
• 申請(qǐng)日: 2022-07-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115992176A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賴(lài)良學(xué);王可品;金琴
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N15/65;C12N15/63;C12N15/55;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京品源專(zhuān)利代理有限公司 11332
• 代理人: 王艷齋

本發(fā)明公開(kāi)了一種構(gòu)建可通過(guò)藥物誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)的模型豬的方法。所述方法包括將rtTA調(diào)控元件敲入豬細(xì)胞基因組Rosa26位點(diǎn)，將Cas9蛋白表達(dá)元件敲入豬細(xì)胞基因組Hipp11位點(diǎn)，所述rtTA調(diào)控元件含有rtTA蛋白編碼基因，所述Cas9蛋白表達(dá)元件含有TRE3G啟動(dòng)子和Cas9蛋白編碼基因，所述TRE3G啟動(dòng)子啟動(dòng)Cas9蛋白編碼基因表達(dá)。本發(fā)明獲得的模型豬可以實(shí)現(xiàn)一豬多用，是豬體內(nèi)簡(jiǎn)便高效的基因修飾操作的實(shí)施基礎(chǔ)，模型豬具有可穩(wěn)定傳代的遺傳元件，利于推廣應(yīng)用，為豬條件性體內(nèi)基因組和表觀基因組編輯提供強(qiáng)大而靈活的平臺(tái)，促進(jìn)基因修飾豬模型在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種構(gòu)建可通過(guò)藥物誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)的模型豬的方法。

背景技術(shù)

豬不僅是為人類(lèi)提供食物的重要家畜，也是生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)的理想模型，它們?cè)诿庖呦到y(tǒng)，解剖學(xué)，生理學(xué)，器官大小和新陳代謝方面與人類(lèi)有許多相似之處。盡管基因修飾豬模型并不像嚙齒動(dòng)物模型那樣被廣泛使用，但迄今為止已經(jīng)產(chǎn)生了越來(lái)越多的對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、異種移植和人類(lèi)疾病模型至關(guān)重要的基因修飾豬。由于具有生殖系嵌合能力的豬胚胎干細(xì)胞尚未成功建系，目前基因修飾豬主要通過(guò)直接胚胎顯微注射包含CRISPR的組分或應(yīng)用CRISPR系統(tǒng)在體細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯，然后進(jìn)行體細(xì)胞核移植(SCNT)克隆，然而這兩種方法繁瑣，費(fèi)力，低效且耗時(shí)。

有研究報(bào)道通過(guò)將SpCas9和sgRNA的表達(dá)載體直接遞送到成年小鼠的特定組織中直接進(jìn)行體內(nèi)基因組編輯(Platt?et?al.,2014,Sanchez-Rivera?et?al.,2014,Xue?etal.,2014,Swiech?et?al.,2015,Dow?et?al.,2015)，然而，總體編輯效率較低，為了克服這個(gè)問(wèn)題，進(jìn)一步構(gòu)建了Cre依賴(lài)性SpCas9表達(dá)盒特異性插入Rosa26基因座的小鼠模型，隨后，將靶向目的基因的sgRNA和Cre引入特定的體內(nèi)器官/組織/細(xì)胞，以此簡(jiǎn)便有效地進(jìn)行體內(nèi)基因組編輯。最近，組成型表達(dá)Cas9的動(dòng)物模型(例如ROSA26-SpCas9轉(zhuǎn)基因豬)的產(chǎn)生顯著降低了病毒載體的包裝大小和需要遞送的組分的數(shù)量，從而促進(jìn)了體內(nèi)基因編輯。然而，由不可控制的SpCas9表達(dá)引起的基因組損傷(XU?S?X,KIM?J,TANG?Q?S,etal.2020.CAS9?is?a?genome?mutator?by?directly?disrupting?DNA-PKdependentDNArepair?pathway.ProteinCell[J],11:352-365.)，脫靶效應(yīng)(FU?Y?F,FODENJ?A,KHAYTER?C,et?al.2013.High-frequency?off-target?mutagenesis?induced?byCRISPR-Cas?nucleases?in?human?cells.Nature?Biotechnology[J],31:822-+.)和免疫清除反應(yīng)將阻礙具有該組成型SpCas9表達(dá)系統(tǒng)的動(dòng)物模型的應(yīng)用，這對(duì)于基于Cre重組酶系統(tǒng)的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)也是不可避免的，因?yàn)镃re激活后存在可持續(xù)的組成型SpCas9表達(dá)。此外，Cre重組酶被證實(shí)對(duì)豬胚胎發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響(WHITWORTH?K?M,CECIL?R,BENNE?J?A,et?al.2018.Zygote?injection?ofRNA?encoding?Cre?recombinase?results?inefficient?removal?ofLoxP?flanked?neomycin?cassettes?in?pigs.TransgenicResearch[J],27:167-178.)并且在哺乳動(dòng)物基因組中具有假重組位點(diǎn)的潛在遺傳毒性。

綜上所述，提供一種高效構(gòu)建基因修飾模型豬的方法，對(duì)于疾病治療和藥物研發(fā)領(lǐng)域具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和實(shí)際需求，本發(fā)明提供一種構(gòu)建可通過(guò)藥物誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)的模型豬的方法，構(gòu)建可通過(guò)藥物誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)的模型豬，以期解決目前Cas9蛋白在大動(dòng)物豬上直接進(jìn)行體內(nèi)遞送存在成本高、效率低、免疫原性大等問(wèn)題，以及Cas9蛋白的長(zhǎng)期或持續(xù)性表達(dá)引起的脫靶、基因組損傷等問(wèn)題。