[發明專利]一種脂肪間充質干細胞儲存液

有效

• 申請號: 202210819387.8
• 申請日: 2022-07-12
• 公開（公告）號: CN115176796B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 徐智峰;張新;李智耀
• 申請（專利權）人: 廣州沙艾生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 吳澤燊

本發明提供了一種脂肪間充質干細胞儲存液，其特征在于，所述儲存液包括ε?聚賴氨酸?g?丙氨酸?g?海藻糖、海藻糖、山梨糖醇、1,2?丙二醇和胎牛血清蛋白。本發明的脂肪間充質干細胞儲存液充分利用并改善海藻糖的低溫保護作用，通過合成的含有疏水氨基酸的ε?聚賴氨酸?g?丙氨酸?g?海藻糖，ε?聚賴氨酸?g?丙氨酸?g?海藻糖具有膜擾動活性，與細胞膜相互作用可在細胞膜局部形成微孔，提高了細胞中海藻糖載入量。ε?聚賴氨酸?g?丙氨酸?g?海藻糖與海藻糖搭配，在降溫冷凍過程時，海藻糖可以在細胞內外更有效地防止冰晶損傷，提高細胞冷凍的存活率，山梨糖醇的存在能夠更大程度地改善上述作用，進一步改善冷凍效果。

技術領域

本發明涉及細胞儲存領域，具體涉及脂肪間充質干細胞儲存液。

背景技術

從脂肪組織中獲取間充質干細胞是成體干細胞來源的最佳途徑，它在體外增殖快、衰亡率低、分化能力強，同時具有儲備量大、取材容易、經體外擴增后具有較低的免疫原性和良好的免疫調節功能等優點，非常具有臨床應用潛力，可以治療多種疑難病癥并已取得了突破性進展。因此，脂肪間充質干細胞的儲存有重要意義。

目前，多采用二甲亞砜(10％)和胎牛血清蛋白(FBS)(90％)的凍存液冷凍保存干細胞，但是，這些冷凍劑中高濃度冷凍劑的細胞毒性作用，如二甲亞砜不利于細胞的恢復。也有人研究通過1，2-丙二醇、甘油替換二甲亞砜作為冷凍液，但是冷凍效果尚且不如二甲亞砜。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供一種脂肪間充質干細胞儲存液。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種脂肪間充質干細胞儲存液，所述儲存液包括ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖、海藻糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；

所述儲存液中各組分的比例如下：

所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的體積比為(3％～5％)：(97％～95％)；

所述ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的濃度為0.2～1mg/mL；

所述海藻糖的濃度為0.25～0.5mol/L；

所述山梨糖醇的質量濃度為2w/v％～4w/v％。

海藻糖是由兩分子葡萄糖組成的非還原性二糖，其化學性質十分穩定，對酸、熱都呈化學惰性，對多種生物體具有非特異性保護作用，可以穩定細胞膜、蛋白質、核酸等生物活性物質。海藻糖還有低溫保護作用，是一種良好的冷凍保護劑。細胞內海藻糖的存在可以增強細胞凍存的存活率，即在結冰過程中，細胞內海藻糖的存在可減弱滲透壓變化帶來的破壞作用。海藻糖屬于非滲透型二糖，很難穿過細胞膜到細胞內。

本發明充分利用并改善海藻糖的低溫保護作用，通過合成的含有疏水氨基酸的ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖，ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖具有膜擾動活性，與細胞膜相互作用可在細胞膜局部形成微孔，提高了細胞中海藻糖載入量。ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖與海藻糖搭配，在降溫冷凍過程時，海藻糖可以在細胞內外更有效地防止冰晶損傷，提高細胞冷凍的存活率，山梨糖醇的存在能夠更大程度地改善上述作用，進一步改善冷凍效果。

優選地，所述ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的制備方法包括以下步驟：

(1)將叔丁氧羰基-β-丙氨酸(BOC-Ala-OH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于二甲亞砜(DMSO)溶劑中攪拌25～40分鐘得到二甲亞砜溶液體系；加入ε-聚賴氨酸水溶液，于20～30℃攪拌反應48～96小時；將反應后的產物透析，透析袋的規格為1800Da～2200Da，得到ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸的前體物，所述前體物中的丙氨酸基團的氨基由叔丁氧羰基保護；