[發明專利]一種脂肪間充質干細胞儲存液

有效

• 申請號: 202210819387.8
• 申請日: 2022-07-12
• 公開（公告）號: CN115176796B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 徐智峰;張新;李智耀
• 申請（專利權）人: 廣州沙艾生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 吳澤燊

1.一種脂肪間充質干細胞儲存液，其特征在于，所述儲存液包括ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖、海藻糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；

所述儲存液中各組分的比例如下：

所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的體積比為(3％～5％)：(97％～95％)；

所述ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的濃度為0.2～1mg/mL；所述ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的制備方法包括以下步驟：

(1)將叔丁氧羰基-β-丙氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺溶于二甲亞砜溶劑中攪拌25～40分鐘得到二甲亞砜溶液體系；

其中，二甲亞砜溶液體系中，叔丁氧羰基-β-丙氨酸的濃度為30～45g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為70～100g/L，N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為40～60g/L；

加入ε-聚賴氨酸水溶液，所述ε-聚賴氨酸水溶液的濃度為80～150mg/L；于20～30℃攪拌反應48～96小時；將反應后的產物透析，透析袋的規格為1800Da～2200Da，得到ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸的前體物，所述前體物中的丙氨酸基團的氨基由叔丁氧羰基保護；

(2)還原前體物上叔丁氧羰基保護的氨基，得到ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸；

(3)將羧基化海藻糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺溶于水中攪拌25～40分鐘活化得到羧基化海藻糖反應體系；

其中，羧基化海藻糖反應體系中，羧基化海藻糖的濃度為80～150g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為40～60g/L、N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為20～30g/L；

加入濃度為0.08～0.12mg/mL的ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸二甲亞砜溶液，于20～30℃攪拌反應48～96小時；將反應后的產物透析，透析袋的規格為1800Da～2200Da，得到ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖；

羧基化海藻糖的分子結構為：

所述羧基化海藻糖的制備工藝為：

(a)在三口燒瓶中加入15～25mg/mL海藻糖無水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，放入75～85℃加熱，通氮氣，磁子攪拌；

(b)在三口燒瓶中再加入40～60mg/mL丁二酸酐無水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，加入三乙胺混合；海藻糖與丁二酸酐的質量比為(3.5～4):1；

(c)三口瓶密封，75～85℃下反應12h；

(d)反應結束后減壓蒸餾出DMF，濃縮溶液后用過量乙醚沉淀產物；

(e)再次用少量無水DMF溶解沉淀產物后用過量乙醚沉淀純化，將沉淀物不高于50℃干燥，得到乳白色泡沫狀固體，即為羧基化海藻糖；

所述海藻糖的濃度為0.25～0.5mol/L；

所述山梨糖醇的質量濃度為2w/v％～4w/v％。

2.根據權利要求1所述的脂肪間充質干細胞儲存液，其特征在于，所述步驟(1)中，叔丁氧羰基-β-丙氨酸與ε-聚賴氨酸的質量比為(1.5～2)：1。

3.根據權利要求1所述的脂肪間充質干細胞儲存液，其特征在于，所述步驟(3)中，羧基化海藻糖與ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸的質量比為(1.2～1.5)：1。

4.根據權利要求1所述的的脂肪間充質干細胞儲存液，其特征在于，所述ε-聚賴氨酸的平均分子量為3500～4500Da。

5.根據權利要求1所述的脂肪間充質干細胞儲存液，其特征在于，所述ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的濃度為0.5～0.8mg/mL。

6.根據權利要求1所述的脂肪間充質干細胞儲存液，其特征在于，所述海藻糖的濃度為0.35～0.4mol/L。

7.根據權利要求1所述的脂肪間充質干細胞儲存液，其特征在于，所述步驟(2)中，對于還原前體物上叔丁氧羰基保護的氨基，采用如下方法：

將ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸的前體物溶于三氟乙酸，并在室溫下攪拌反應4h；反應完畢后，依次經過量乙醚沉淀，離心，水透析3天，凍干得到ε-聚賴氨酸-g-丙氨酸。