[發明專利]一種真皮微血管周細胞的純化、鑒定方法及純化得到的細胞

在審

• 申請號: 202210818955.2
• 申請日: 2022-07-12
• 公開（公告）號: CN115094024A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 趙銀花;林煌;李文志;馬嘉興;崔玥
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京安貞醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02;G01N33/58;G01N33/561;G01N33/68
• 代理公司: 北京開陽星知識產權代理有限公司 11710
• 代理人: 董亞男

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種真皮微血管周細胞的純化、鑒定方法及純化得到的細胞。純化方法包括：取皮膚組織，修剪保留真皮組織；將修剪后的皮膚組織采用中性蛋白酶水解，分離表皮和真皮；將真皮使用膠原酶消化；過濾，收獲細胞懸液，離心，使用周細胞培養基培養細胞；當培養皿中細胞密度達80％～90％，棄去周細胞培養基，洗滌，吹打培養皿，得到細胞懸液，離心，保留細胞沉淀，用周細胞培養基重懸細胞，再次接種到培養皿中；重復純化一次，獲得真皮微血管周細胞。本發明提出了一種分離效果好、操作簡單的真皮微血管周細胞的純化方法，本方法可以提供數量充足、來源可靠、質量穩定的真皮微血管周細胞。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種真皮微血管周細胞的純化、鑒定方法及純化得到的細胞。

背景技術

在過去幾十年間我們對真皮微血管有了更加廣泛和深入的認識。盡管對真皮微血管的結構和功能有了實質性的進展，但包括增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、皮瓣缺氧再灌注損傷、銀屑病等真皮微血管異常疾病依然是世界性難題。研究發現在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩等真皮微血管異常疾病中均存在不同程度的缺氧，而血管對氧氣的運輸至關重要。因此矯正真皮微血管異常顯得尤為重要。

真皮微血管的形成，包括內皮細胞的增殖和遷移，血管基底膜的發展，以及隨后包括周細胞在內的支持細胞的募集。周細胞在穩定血管壁、控制血管擴張、調節血流灌注等方面起著重要的調節作用。然而目前在真皮微血管異常疾病如增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、皮瓣移植等，周細胞的作用極少被提及。

研究發現肺、心臟、視網膜、腎等組織的微血管出現異常后，微血管周細胞的數量和功能改變，并與內皮細胞分離從微血管中脫落，而且新生血管周細胞的覆蓋率低，導致血管完整性受損。在皮瓣缺氧再灌注損傷動物實驗中也發現，缺氧再灌注損傷導致真皮微血管周細胞受損，表現為數量減少、從微血管脫落。另一方面，在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中發現，大多數新生微血管存在不同程度的血管滲漏，說明周細胞與內皮細胞比例存在異常。因此更應重視周細胞在真皮微血管異常疾病中的作用。

因此，研究周細胞對真皮微血管的調控，可為今后研究真皮微血管異常疾病創造有利條件。為解決以上的科學及臨床問題，亟需一種真皮微血管周細胞的純化及鑒定方法。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種真皮微血管周細胞的純化、鑒定方法及純化得到的細胞。

本發明提供了一種真皮微血管周細胞的純化方法，至少包括以下步驟：

S1、取皮膚組織，修剪保留真皮組織；

S2、將修剪后的皮膚組織采用中性蛋白酶水解，分離表皮和真皮；

S3、將真皮使用膠原酶消化；

S4、將消化后的真皮過濾，收獲細胞懸液，將細胞懸液離心后，使用周細胞培養基培養細胞；

S5、當培養皿中細胞密度達80％～90％，棄去周細胞培養基，使用PBS洗滌細胞2～3次，最后一次洗滌后細胞中保留PBS，吹打培養皿20～40次，吹打的頻率為每2～5秒一次，得到細胞懸液，離心，保留細胞沉淀，用周細胞培養基重懸細胞，再次接種到培養皿中；

S6、重復S5，獲得真皮微血管周細胞。

可選的，在S2中，中性蛋白酶水解的條件為在0～5℃條件下孵育8～16小時；中性蛋白酶溶液的濃度為2mg/mL。

可選的，在S3中，膠原酶的濃度為1.25mg/mL，消化的條件為35℃～38℃，時間為30～50分鐘；消化過程中，每間隔8～12分鐘將容器上下倒置5～10次。

可選的，在S4中，先加入周細胞培養基終止消化，然后將消化后得到的真皮瓣組織以及消化液于70μm的濾器中過濾，沖洗，獲得細胞懸液；周細胞培養基與膠原酶的體積比為1：0.5～1。