[發明專利]一種真皮微血管周細胞的純化、鑒定方法及純化得到的細胞

在審

• 申請號: 202210818955.2
• 申請日: 2022-07-12
• 公開（公告）號: CN115094024A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 趙銀花;林煌;李文志;馬嘉興;崔玥
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京安貞醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02;G01N33/58;G01N33/561;G01N33/68
• 代理公司: 北京開陽星知識產權代理有限公司 11710
• 代理人: 董亞男

1.一種真皮微血管周細胞的純化方法，其特征在于，至少包括以下步驟：

S1、取皮膚組織，修剪保留真皮組織；

S2、將修剪后的皮膚組織采用中性蛋白酶水解，分離表皮和真皮；

S3、將真皮使用膠原酶消化；

S4、將消化后的真皮過濾，收獲細胞懸液，將細胞懸液離心后，使用周細胞培養基培養細胞；

S5、當培養皿中細胞密度達80％～90％，棄去周細胞培養基，使用PBS洗滌細胞2～3次，最后一次洗滌后細胞中保留PBS，吹打培養皿20～40次，吹打的頻率為每2～5秒一次，得到細胞懸液，離心，保留細胞沉淀，用周細胞培養基重懸細胞，再次接種到培養皿中；

S6、重復S5，獲得真皮微血管周細胞。

2.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，在S2中，所述中性蛋白酶水解的條件為在0～5℃條件下孵育8～16小時；所述中性蛋白酶溶液的濃度為2mg/mL。

3.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，在S3中，所述膠原酶的濃度為1.25mg/mL，所述消化的條件為35℃～38℃，時間為30～50分鐘；消化過程中，每間隔8～12分鐘將容器上下倒置5～10次。

4.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，在S4中，先加入周細胞培養基終止消化，然后將消化后得到的真皮瓣組織以及消化液于70μm的濾器中過濾，沖洗，獲得細胞懸液；

所述周細胞培養基與所述膠原酶的體積比為1：0.5～1。

5.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，在S4中，所述離心的條件為：時間為4～6min，速率800～1200r/min；離心后棄去上清液，保留細胞沉淀，使用周細胞培養基重懸細胞，繼續培養；將培養皿置于細胞培養箱內孵育，間隔2～3天換液。

6.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，在S5中，所述離心的條件為：時間為4～6min，速率800～1200r/min；

使用PBS洗滌細胞時，采用八字法搖晃細胞5～10次為洗滌一次，搖晃的頻率為每3～5秒晃動一次；

使用移液槍吹打培養皿，按壓移液槍的速度以不產生氣泡為準。

7.根據權利要求1、4或5所述的純化方法，其特征在于，所述周細胞培養基的組成為：500mL基礎培養基、8～12mL胎牛血清、4～6mL周細胞生長因子和4～6mL青霉素或鏈霉素；青霉素的濃度為10,000U/mL，鏈霉素的濃度為10,000μg/mL。

8.一種采用如權利要求1～7任一項所述的純化方法所獲得的真皮微血管周細胞。

9.一種真皮微血管周細胞的鑒定方法，其特征在于，采用免疫熒光法和/或蛋白免疫印跡法進行鑒定，

培養所述如權利要求8所述真皮微血管周細胞，采用α-SMA、PDGFR-β和CD31一抗對多聚甲醛固定后的細胞進行孵育，加入二抗孵育后采集信號；

培養所述如權利要求8所述真皮微血管周細胞，采用α-SMA、PDGFR-β和CD31一抗與轉移后的蛋白進行孵育后，采用熒光標記二抗孵育后采集信號；

免疫熒光法結果中α-SMA染色為陽性、PDGFR-β染色為陽性、CD31為陰性時，鑒定為真皮微血管周細胞；

蛋白免疫印跡法結果中α-SMA和PDGFR-β表達、CD31不表達，鑒定為真皮微血管周細胞。

10.根據權利要求9所述的鑒定方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

所述免疫熒光法：培養所述真皮微血管周細胞，待細胞密度達80％～90％后，多聚甲醛固定，清洗，分別加入α-SMA、PDGFR-β、CD31一抗孵育，清洗，加入二抗后孵育，清洗，采集信號；

所述蛋白免疫印跡法：培養所述真皮微血管周細胞，待細胞密度達80％～90％后，收集細胞，使用BCA蛋白定量法進行蛋白定量，使用分離膠和濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后剝離膠并剪切下來，將蛋白轉移到PVDF膜上；封閉，分別加入α-SMA、PDGFR-β和CD31一抗孵育，清洗；熒光標記二抗孵育，清洗，采集信號。