[發明專利]一種同時檢測七種細胞因子的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202210811036.2
• 申請日: 2022-07-11
• 公開（公告）號: CN115015562A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 郭愛龍;元卿;李娜
• 申請（專利權）人: 杭州九盛生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 北京精翰專利代理有限公司 11921
• 代理人: 劉曉暉

一種同時檢測七種細胞因子的方法及試劑盒，包括包被七種細胞因子抗體的微球混合液、檢測抗體、細胞因子標準品、樣品稀釋液和洗液，所述的七種細胞因子為IL?2、IL?4、IL?6、IL?10、IL?17、TNF?α和IFN?γ，本發明能同時檢測出樣本中IL?2、IL?4、IL?6、IL?10、IL?17、TNF?α、IFN?γ七種細胞因子的濃度，解決檢測一個樣本中七種細胞因子需要單獨用七種檢測試劑檢測的問題，實現單樣本多重定量檢測、節約時間和成本、檢測濃度范圍廣、需要樣本量少、步驟簡單易操作、效率更高。

技術領域

本發明涉及體外免疫檢測技術領域，具體是指一種應用流式熒光發光法同時檢測七種細胞因子的方法及試劑盒。

背景技術

細胞因子(cytokine，CK)是由免疫細胞(單核細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等)和某些非免疫細胞(內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等)經刺激而合成分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質，參與機體免疫反應和炎癥反應。根據產生細胞因子的細胞種類不同分類：白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。

目前常用的細胞因子檢測方法有：酶聯免疫檢測(ELISA)、放射性免疫檢測(RIA)、化學發光免疫檢測(CLIA)、免疫印跡法(Westernblot)等。酶聯免疫檢測(ELISA)一次只能檢測單一樣本，檢測通量小、成本高等不足。放射性免疫檢測(RIA)由于具有放射性污染，已經很少用。化學發光免疫檢測(CLIA)也不能同時對單個樣本中的多個指標進行檢測。

流式細胞術是利用流式細胞儀對處于快速直線流動狀態中的細胞或生物顆粒同時進行多參數高通量檢測、快速定量分析和分選的高新技術。流式熒光發光法是一種基于流式細胞檢測的多重蛋白定量分析的檢測方法，能夠同時對單個樣本中的多個指標進行檢測。把不同的捕獲抗體包被在不同大小的熒光編碼微球上，與待測樣本、檢測抗體混合孵育，形成捕獲微球-抗原-檢測抗體復合結構。通過對微球和報告分子的檢測實現同時對樣本中的不同細胞因子的定量檢測。然而其他的細胞因子檢測方法，比如酶聯免疫檢測、化學發光免疫檢測等方法無法對同一個樣本在同一個反應體系中區分不同的檢測分子信號。因此，有必要開發一種能夠同時檢測多種細胞因子的試劑盒，以克服現有技術中亟待解決的問題。

發明內容

本發明要解決上述技術問題，提供一種能夠同時檢測多種細胞因子、檢測靈敏度高、高通量、樣品用量少、檢測濃度范圍廣的方法及試劑盒。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：

一種同時檢測七種細胞因子的試劑盒，包括包被七種細胞因子抗體的微球混合液、檢測抗體、細胞因子標準品、樣品稀釋液和洗液，所述的七種細胞因子為IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和IFN-γ；

其中，所述的微球混合液為4um和5um不同熒光編碼的聚苯乙烯羧基化微球分別與七種細胞因子捕獲抗體偶聯，得到七種細胞因子抗體捕獲微球，按照每人份每種微球2000個制備七種細胞因子抗體捕獲的微球混合液；

其中，所述的檢測抗體為把七種細胞因子的檢測抗體用藻紅蛋白進行標記，用SANH與檢測抗體反應，得到活化的檢測抗體-SANH，用SFB與PE反應，得到活化的PE-SFB，把活化的檢測抗體-SANH和活化的PE-SFB混合反應，得到檢測抗體-PE偶聯混合物，利用分子篩，采用AKTA進行純化，得到檢測抗體-PE；

其中，所述的細胞因子標準品通過NIBSC標準品對IL-10、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17細胞因子重組蛋白溶液分別校準，校準后的細胞因子重組蛋白溶液，用蛋白保存液稀釋至終濃度10000pg/ml，混合一起，用凍干機凍干細胞因子重組蛋白混合液制成凍干粉；

其中，所述的樣品稀釋液為向0.01M磷酸鹽緩沖液中加入1％牛血清白蛋白和0.2％Proclin950,充分混勻；