[發明專利]一種同時檢測七種細胞因子的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202210811036.2
• 申請日: 2022-07-11
• 公開（公告）號: CN115015562A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 郭愛龍;元卿;李娜
• 申請（專利權）人: 杭州九盛生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 北京精翰專利代理有限公司 11921
• 代理人: 劉曉暉

1.一種同時檢測七種細胞因子的試劑盒，其特征在于，包括包被七種細胞因子抗體的微球混合液、檢測抗體、細胞因子標準品、樣品稀釋液和洗液，所述的七種細胞因子為IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和IFN-γ；

其中，所述的微球混合液為4um和5um不同熒光編碼的聚苯乙烯羧基化微球分別與七種細胞因子捕獲抗體偶聯，得到七種細胞因子抗體捕獲微球，按照每人份每種微球2000個制備七種細胞因子抗體捕獲的微球混合液；

其中，所述的檢測抗體為把七種細胞因子的檢測抗體用藻紅蛋白進行標記，用SANH與檢測抗體反應，得到活化的檢測抗體-SANH，用SFB與PE反應，得到活化的PE-SFB，把活化的檢測抗體-SANH和活化的PE-SFB混合反應，得到檢測抗體-PE偶聯混合物，利用分子篩，采用AKTA進行純化，得到檢測抗體-PE；

其中，所述的細胞因子標準品通過NIBSC標準品對IL-10、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17細胞因子重組蛋白溶液分別校準，校準后的細胞因子重組蛋白溶液，用蛋白保存液稀釋至終濃度10000pg/ml，混合一起，用凍干機凍干細胞因子重組蛋白混合液制成凍干粉；

其中，所述的樣品稀釋液為向0.01M磷酸鹽緩沖液中加入1％牛血清白蛋白和0.2％Proclin950,充分混勻；

其中，所述的洗液為向0.1M磷酸緩沖液中加入0.5％Tween-20和0.2％Proclin950,充分混勻。

2.根據權利要求1所述的一種同時檢測七種細胞因子的試劑盒，其特征在于：所述的4μm微球制備IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ捕獲微球，所述的5μm微球制備IL-4和IL-17捕獲微球。

3.根據權利要求1所述的一種同時檢測七種細胞因子的試劑盒，其特征在于：所述的磷酸鹽緩沖液的PH值為7-7.5。

4.一種同時檢測七種細胞因子的方法，其特征在于：所述方法包括以下操作步驟：

S1：標準曲線準備：①取出標準品管，瞬時離心，加入樣品稀釋液，輕柔震蕩后靜置5～10分鐘，作為標準曲線最高濃度，標記為S1；②取7個新的離心管，標記為S2～S7，每管加入樣品稀釋液，從S1管中取一定量的液體，加入S2管中混勻，從S2管中取一定量的液體加入S3管中混勻，從S3管中取一定量的液體加入S4管中混勻，從S4管中取一定量的液體加入S5管中混勻，從S5管中取一定量的液體加入S6管中混勻，從S6管中取一定量的液體加入S7管中混勻，進行倍比稀釋，記作S1-S7不同濃度的樣品稀釋混合液；

S2：檢測試劑準備：根據制備標準曲線的管數和待測樣本的管數計算所需1×洗液的量，將洗液用超純水按比例稀釋即得；

S3：樣本制備：樣本如為冷凍保存，應提前取出，緩慢融化，恢復至室溫；樣本如為血液，離心后輕輕取上清；

S3：根據標準品管和待測樣本數量，準備適量流式管，每管加入捕獲微球混合液和樣品稀釋液；

S4：取8個流式管，分別標記A1～A8，其中A1～A7管加入S1步驟中對應梯度S1-S7樣品管中的樣品稀釋混合液，A8管加入樣品稀釋液，作為空白管，待測樣本管加入樣本；

S5：A1～A8管加入生物素標記的檢測試劑，渦旋震蕩混勻，室溫避光震蕩孵育；

S6：孵育結束后，每管加入鏈霉親和素-PE，室溫避光震蕩孵育；

S7：孵育結束后，每管加入檢測試劑，渦旋震蕩混勻，離心，棄上清；

S8：每管加入檢測試劑，渦旋振蕩，重懸微球；

S9：設置實驗方案：取捕獲微球混合液，加入檢測試劑混勻，上機建立模板，具體步驟如下：

①建立X軸為FSC、Y軸為SSC的線性散點圖，根據FSC，圈中微球；

②建立PE即X軸和APC即Y軸的對數散點圖，顯示圈中的微球；

③低速采集微球，調節PE通道電壓，使微球位于左側，不要壓線；

④保存模板和條件；

S10：采集數據：依次檢測標準品和樣本。

5.根據權利要求4所述的一種同時定量檢測十二種細胞因子的方法，其特征在于：所述S3中，捕獲微球混合液在加入前先進行渦旋處理。