[發明專利]細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法

有效

• 申請號: 202210810774.5
• 申請日: 2022-07-11
• 公開（公告）號: CN115011548B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 蔡蕓;楊天立;陳輝玲;白楠;梁蓓蓓;梁文馨;王瑾
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0786;C12N5/078;C12N1/20;C12R1/22
• 代理公司: 北京京萬通知識產權代理有限公司 11440
• 代理人: 齊曉靜

細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，包括：S1.將固定于Matrigel中的PDLO消化下來，添加培養基制備成PDLO懸液并計數；S2.懸浮培養PDLO懸液，以修復消化下來的PDLO；S3.將單克隆菌落培養制備為定量細菌懸液；S4.將定量細菌懸液加入PDLO懸液中，建立細菌感染肺類器官模型；以及S5.提取原代PBMC計數后加入細菌感染肺類器官模型中，以構建細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系。本方法構建了多細胞種類的PDLO并與常見致病菌及外周血單個核細胞共培養，能夠顯著提高PDLO細菌感染肺類器官模型與免疫微環境混合共存體系的構建效率，有效且穩定地模擬人體肺部感染后的機體抗感染反應及免疫反饋的過程。

技術領域

本發明涉及細胞感染技術領域，尤其涉及一種細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法。

背景技術

“類器官(Organoid)”一詞早在1946年便被用來描述腫瘤的某些組織學特征^[1]。然而，直到2009年腸類器官的發展^[2]，它才開始專用于描述自組織的體外結構。類器官可用于模擬人體器官發育和各種疾病的病理變化^[3]，而患者來源的類器官(Patient-derivedOrganoid,PDO)則可以進行廣泛的分子診斷和藥物篩選，有望以個體化的方式預測機體對藥物反應。目前，對于PDO的研究主要應用于各類腫瘤的免疫調節方面，在感染性疾病免疫調節中的應用很少。

在COVID-19的疾病進程中，患者的自身免疫功能也同時影響著病情變化。疾病早期患者僅表現為病毒性感染的一般癥狀，如果患者的免疫系統過度激活、炎癥因子急劇增加，形成炎癥因子風暴后，死亡率由輕型或普通型的＜4％顯著增長至重型或危重型的＞50％^[5-8]。因此，病程早期進行免疫調節治療對降低重癥轉化率和死亡率有重要意義^[9,10]。不僅針對病毒性感染，全身免疫功能失調是多種病原體感染性疾病的病理生理基礎的基本分子機制，可以導致嚴重的膿毒癥和敗血癥性休克^[11]。免疫系統在炎癥性疾病中發揮的重要作用也備受關注。

肺類器官(Lung organoid)主要由兩種來源的細胞構建而成：從成熟肺組織分離的上皮干/祖細胞^[12]和人類多能干細胞^[13-15]，前者來源的肺類器官稱之為患者來源肺類器官(Patient-derived Lung Organoid,PDLO)，主要包括基底祖細胞、氣道分泌細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial type 2,AT2 cells) 等。建立PDLO有助于進一步了解人類肺部的發育過程和肺部疾病的病理生物學，這兩點都是尋找治療呼吸系統疾病新方法的關鍵。目前為止，人類肺部發育、修復和再生的幾個重要研究結果都是從小鼠模型中推斷出來的^[16]。然而，人與鼠的肺組織之間存在著許多內在差異，如基底細胞遍布于人體氣道，但在小鼠中僅限于氣管，亦如杯狀細胞在人呼吸道中常見，但在小鼠中少見等。雖然肺上皮細胞系能夠表現出人類肺組織的一些表性特征，但這些細胞系只能單層培養，并且很難通過其進一步了解肺組織發育和形成過程的影響因素，如上皮-間充質相互作用和分支形態發生等^[17]。因此，建立能夠還原人體環境的體外模型是準確研究人肺發育和疾病病程的關鍵。