[發明專利]細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法

有效

• 申請號: 202210810774.5
• 申請日: 2022-07-11
• 公開（公告）號: CN115011548B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 蔡蕓;楊天立;陳輝玲;白楠;梁蓓蓓;梁文馨;王瑾
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0786;C12N5/078;C12N1/20;C12R1/22
• 代理公司: 北京京萬通知識產權代理有限公司 11440
• 代理人: 齊曉靜

1.一種細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.將固定于基底膜基質(Matrigel)中的患者來源肺類器官(PDLO)消化下來，添加培養基制備成患者來源肺類器官(PDLO)懸液并計數；

S2.懸浮培養所述患者來源肺類器官(PDLO)懸液，以修復消化下來的所述患者來源肺類器官(PDLO)；

S3.將單克隆菌落培養制備為定量細菌懸液；

S4.將所述定量細菌懸液加入所述患者來源肺類器官(PDLO)懸液中，建立細菌感染肺類器官模型；以及

S5.提取原代外周血單個核細胞(PBMC)計數后加入所述細菌感染肺類器官模型中，以構建所述細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系。

2.根據權利要求1的所述的細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，其特征在于，在步驟S1中，用II型膠原酶將固定于所述基底膜基質(Matrigel)中的患者來源肺類器官(PDLO)消化下來。

3.根據權利要求2的所述的細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，其特征在于，用濃度為2mg/mL的II型膠原酶將固定于所述基底膜基質(Matrigel)中的患者來源肺類器官(PDLO)在37℃消化10min，用杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)清洗以洗凈所述II型膠原酶。

4.根據權利要求1的所述的細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，其特征在于，在步驟S2中，懸浮培養所述患者來源肺類器官(PDLO)懸液一周。

5.根據權利要求1的所述的細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，其特征在于，在步驟S2中，使用流式管或低吸附孔板進行懸浮培養。

6.根據權利要求1的所述的細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，其特征在于，在步驟S3中，將細菌于MHA瓊脂板中培養傳代至對數生長期后，挑取單克隆菌落至MHB肉湯培養基中，隨后使用麥氏比濁儀對細菌懸液進行定量。

7.根據權利要求6的所述的細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，其特征在于，在步驟S3中，將挑取的所述單克隆菌落在所述MHB肉湯培養基中在37℃振蕩培養16h，隨后使用麥氏比濁儀對細菌懸液進行定量，根據需要的感染復數(MOI)比濁至1.5×10^7CFU/mL特定濃度的細菌懸液。

8.根據權利要求1的所述的細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，其特征在于，在步驟S5中，提取原代外周血單個核細胞(PBMC)并進行計數后，在適當的時間點將外周血單個核細胞(PBMC)懸液加入所述細菌感染肺類器官模型中。

9.根據權利要求8的所述的細菌感染肺類器官模型與免疫微環境共存體系的構建方法，其特征在于，所述外周血單個核細胞(PBMC)懸液的濃度為1.5×10^5個/mL。