[發明專利]一種生物樣品中納呋拉啡的檢測方法

在審

• 申請號: 202210805489.4
• 申請日: 2022-07-08
• 公開（公告）號: CN115015440A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 周曉雯;郝雷;劉歡;馬錚
• 申請（專利權）人: 江蘇杜瑞制藥有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72;G01N30/86;B01J20/281
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1.一種生物樣品中納呋拉啡的檢測方法，其特征在于：采用高效液相色譜-質譜聯用進行測定，包括以下步驟：

S1、標準曲線樣品配制；

S2、質控樣品配制；

S3、內標溶液配制，內標溶液為1ng/mL的納曲酮；

S4、生物樣品前處理，具體包括如下步驟：

S41、將固相萃取小柱活化；

S42、取用1mL生物樣本與500μL內標工作液渦旋混合后，分2次上樣至已活化完成的固相萃取小柱，采用負壓抽濾裝置對樣本進行抽濾，摒棄樣本抽濾液；

S43、采用2mL純水作為淋洗液分2次對已上樣的固相萃取柱進行淋洗，采用負壓抽濾裝置對淋洗液進行抽濾，摒棄抽濾后的淋洗液；

S44、采用1mL 0.1％甲酸甲醇溶液作為洗脫液對已淋洗完成的固相萃取柱進行洗脫，采用負壓抽濾裝置對洗脫液進行抽濾，收集抽濾后的洗脫液；

S45、對收集完成的洗脫液進行氮吹處理，直至洗脫液完全吹干；

S46、復溶吹干后的EP管，渦旋至少2分鐘；

S47、取復溶后樣品至進樣管中，4℃，13000-15000rpm離心5-10分鐘后進樣分析；

S5 LC-MS/MS方法檢測；

通過LC-MS/MS方法檢測，基于待測物與內標的峰面積比，通過歸一化法得到標準曲線，從而定量得到生物樣品中納呋拉啡的濃度。

2.如權利要求1所述的生物樣品中納呋拉啡的檢測方法，其特征在于，S5中LC-MS/MS方法的色譜及質譜條件如下：

色譜條件：液相型號為SHIMADZU LC-20A或SHIMADZU LC-30A；

色譜柱為SHIMADZU Shim-pack GIST C18-AQ，2.1*50mm，3μm；

流動相A相為0.1％甲酸水溶液；

流動相B相為0.1％甲酸甲醇

梯度洗脫條件包括如下五個階段：

第一階段0.00-0.80min：起始流動相比例A:B＝90:10；

第二階段0.80-1.50min：流動相比例由A:B＝90:10B相緩慢上升至A:B＝30:70；

第三階段1.50-2.60min：流動相比例A:B＝30:70；

第四階段2.60-2.61min：流動相比例由A:B＝30:70B相迅速下降至A:B＝90:10；

第五階段2.61-3.50min：流動相比例A:B＝90:10；

流速為：0.8mL/min；進樣量為：5-10μL。

質譜條件：AB SCIEX API 6500+或QTRAP 6500型號質譜，ESI源，正離子，離子噴射電壓為5500V，溫度550-600℃，霧化氣壓力為55psi，解簇電壓壓力為55psi，氣簾氣體壓力為35-40psi，掃描方式為多重反應監測(MRM)，納呋拉啡和內標的質譜參數為：

納呋拉啡的質譜參數為：Q1，477.4；Q3，308.1；Dwell time，200；DP，80；EP，10；CE，42；CXP，18；

納曲酮的質譜參數為Q1，342.4；Q3，270.1；Dwelltime，200；DP，95；EP，10；CE，37；CXP，15；

其中，Q1—母離子(amu)；Q3—子離子(amu)；Dwell time—駐留時間(msec)；DP—去簇電壓(v)；EP—射入電壓(v)；CE—碰撞能量(v)；CXP—碰撞室射出電壓(v)。

3.如權利要求1所述的生物樣品中納呋拉啡的檢測方法，其特征在于，所述生物樣品選自犬的血漿或血清樣品、大鼠的血漿或血清樣品、猴的血漿或血清樣品或受試者的血漿或血清樣品。

4.根據權利要求1所述的生物樣品中納呋拉啡的檢測方法，其特征在于：所述固相萃取法的固相萃取小柱為：Phenomenex，Strata^TM-X(30mg，1cc³)。

5.根據權利要求1所述的生物樣品中納呋拉啡的檢測方法，其特征在于：所述固相萃取時先后使用1mL甲醇和1mL純水進行固相萃取小柱的活化。