[發明專利]高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測方法及其試劑盒與應用

在審

• 申請號: 202210798848.8
• 申請日: 2022-07-06
• 公開（公告）號: CN116064924A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 溫榮輝;翁廣振;王鳳林;張心茹
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 黃宗全

本發明公開了高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測引物對，據此還研制了相應試劑盒并建立了相應檢測方法。該法原理是利用重組酶，單鏈結合蛋白和DNA聚合酶在等溫的條件下擴增高粱花葉病毒P3基因的保守區核酸片段。本發明可用于甘蔗中的高粱花葉病毒檢測，研究表明，本發明方法最低可以檢測到100copies/μL，特異度為100％，適合高粱花葉病毒的快速檢測。與現有技術相比，本發明具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、檢測快速等特點，適于田間現場檢測調查。相應試劑盒檢測快速、結果可靠，可以大規模批量推廣使用。

技術領域

本發明屬于高粱花葉病毒檢測領域，尤其涉及一種高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測方法及其試劑盒與應用。

背景技術

甘蔗是最主要的糖料作物，因其光合作用強，糖份高、可再生性強，并且甘蔗汁可用于發酵生產乙醇，所以甘蔗也是最具潛力的可再生能源作物，巴西、印度和泰國等蔗糖出口大國都在實施以甘蔗為原料生產乙醇的可再生能源計劃。

甘蔗是禾本科無性繁殖作物，在長期無性繁殖以及種植地塊得不到休耕或輪種，長期連續種植甘蔗的情況下，甘蔗中會積累多種病毒，并在無性繁殖過程中通過種莖材料傳播給下一代。從而導致甘蔗種性退化，產量和品質下降，給蔗糖產業帶來嚴重損失。

高粱花葉病毒(SrMV)是分布廣、對甘蔗危害大的病毒之一，該病毒可經蚜蟲叮咬和機械損傷進行近距離傳播，也能通過種莖調運進行遠距離傳播。高粱花葉病毒自然寄主為禾本科的甘蔗和高粱等。高粱花葉病毒(SrMV)會在甘蔗無性繁殖過程中不斷積累，甘蔗病害癥狀也會逐代明顯。被感染的甘蔗葉面會出現黃綠相間不規則的嵌紋、條斑或斑駁，葉色褪綠等癥狀，病狀在幼嫩葉片的基部較明顯，影響光合作用的效率，會造成甘蔗產量和含糖量下降。

目前檢測病毒常用的方法可分為分子檢測技術和血清學檢測技術兩類。其中常見的分子檢測技術有PCR檢測、實時熒光定量PCR檢測和環介導等溫擴增(LAMP)檢測，此類檢測技術不僅對檢測環境和設備要求高，而且檢測周期較長，難以滿足快速檢測大量樣品的需求。常見的血清學檢測技術有ELISA檢測、Dot-ELISA檢測和膠體金試紙條檢測等，此類檢測技術的假陽性較高，適用于大量樣品的初步性檢測，不適于作為確診性檢測；經過初步檢測篩選出的樣品仍然需要采用分子檢測技術進行驗證確診。并且甘蔗種植蔗區較大，采集樣品回實驗室檢測極為不便。因此，建立一種檢測快速、特異靈敏、設備要求低的SrMV高效檢測方法，對田間病害現場調查，防止該病毒傳播，以及建立甘蔗健康種苗體系等具有重要意義。

重組酶介導的等溫核酸擴增(RAA)技術因具有等溫擴增、設備要求低和檢測速度快等優點，正在成為一種快速、特異、高效的鑒定病原微生物的檢測技術。其工作原理是利用重組酶，單鏈結合蛋白和DNA聚合酶在等溫的條件下擴增核酸。與PCR技術相比，RAA檢測方法無需熱變性、溫度循環，適合在非實驗室或者現場條件下進行大量樣品的檢測。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡單、檢測快速的高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測方法及其試劑盒與應用。

為解決上述問題，本發明采用如下技術方案：

高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測引物對，為RAA特異性正向引物和反向引物，它們分別具有序列表SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的堿基序列。

高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測試劑盒，含有上述檢測引物對。

上述檢測試劑盒，包括RAA反應酶系、陽性對照標準品。

RAA反應酶系包括1mM?dNTP、90ng/μL?SSB蛋白、120ng/μL?recA重組酶蛋白、50ng/μL?Rad51、30ng/μL?Bsu?DNA聚合酶、Exo核酸外切酶、100ng/μL肌酸激酶、100mM?Tricine、RAA特異性正向引物和反向引物。