[發(fā)明專利]高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測方法及其試劑盒與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210798848.8
• 申請日: 2022-07-06
• 公開（公告）號: CN116064924A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設計）人: 溫榮輝;翁廣振;王鳳林;張心茹
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產(chǎn)權代理有限公司 45104
• 代理人: 黃宗全

1.高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測引物對，其特征在于為RAA特異性正向引物和反向引物，它們分別具有序列表SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的堿基序列。

2.一種高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測試劑盒，其特征在于含有權利要求1所述檢測引物對。

3.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于包括RAA反應酶系、陽性對照標準品。

4.根據(jù)權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于所述RAA反應酶系包括1mM?dNTP、90ng/μL?SSB蛋白、120ng/μL?recA重組酶蛋白、50ng/μL?Rad51、30ng/μL?Bsu?DNA聚合酶、Exo核酸外切酶、100ng/μL肌酸激酶、100mM?Tricine、RAA特異性正向引物和反向引物。

5.根據(jù)權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于還包括Buffer?A和Buffer?B，BufferA為20％PEG，Buffer?B為280mM醋酸鎂。

6.權利要求1所述的檢測引物對或權利要求2所述的檢測試劑盒用于檢測甘蔗中的高粱花葉病毒。

7.一種高粱花葉病毒的RAA恒溫檢測方法，其特征在于按以下步驟進行：

A.提取總RNA：將適量的待檢甘蔗葉樣品通過液氮處理研磨成粉末，再提取樣品的總RNA；

B.反轉錄：以步驟A中提取的總RNA反轉錄獲得cDNA模板；

C.配置RAA反應體系：在RAA反應酶系中加入45.5μL的20％PEG、2μL的cDNA模板、2.5μL醋酸鎂，以DEPC水代替cDNA模板作為陰性對照，陽性對照標準品代替cDNA模板作為陽性對照，上下顛倒5-6次混勻；

D.恒溫擴增：將混勻的反應體系置于39℃的金屬浴或水浴鍋等溫控裝置中反應20min；

E.檢測結果判定：將反應產(chǎn)物在200V電壓下凝膠電泳15min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察檢測結果；以Maker為參照，在244bp位置有條帶的為陽性；沒有條帶的為陰性。