[發明專利]一種多食性家蠶的分子育種方法及其應用

在審

• 申請號: 202210798614.3
• 申請日: 2022-07-06
• 公開（公告）號: CN116034951A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 黃立華;江健釗;李時宇;馮興暴;袁雅菲;楊振文
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;C12N15/85;C12N15/89;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/12
• 代理公司: 深圳市創富知識產權代理有限公司 44367
• 代理人: 梁嘉朗

1.一種多食性家蠶的分子育種方法，其特征在于，通過基因編輯技術使家蠶缺失GR66基因或使家蠶的GR66基因表達量降低，從而培育出多食性家蠶。

2.根據權利要求1所述的一種多食性家蠶的分子育種方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、針對家蠶GR66基因設置引物，對家蠶基因組cDNA進行PCR擴增；

S2、以家蠶Gr66基因的外顯區域作為靶位點合成sgRNA引物，然后通過PCR獲得sgRNA的雙鏈DNA，再體外轉錄合成sgRNA；

S3、用步驟S2的sgRNA與cas9蛋白對家蠶基因組DNA進行切割，獲取具有體外切割活性的sgRNA；

S4、將步驟S3的sgRNA與cas9蛋白一起注入發育早期的家蠶卵內，然后將鑒定出GR66基因發生了移碼突變的陽性個體與野生型個體交配，再從下代挑選發生了移碼突變的陽性個體進行自交，最后從自交后代中鑒定出純合的缺失突變體，即為多食性家蠶。

3.根據權利要求2所述的一種多食性家蠶的分子育種方法，其特征在于，步驟S1所述引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物和下游引物分別如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示。

4.根據權利要求2所述的一種多食性家蠶的分子育種方法，其特征在于，步驟S1所述PCR擴增的體系為：rTaq酶0.3μL、10×PCR?Buffer?2μL、家蠶cDNA?1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTP?2μL、滅菌水12.7μL。

5.根據權利要求1所述的一種多食性家蠶的分子育種方法，其特征在于，步驟S2所述外顯區域為第4個外顯區域，所述第4個外顯區域如SEQ?ID?NO：3所示。

6.根據權利要求1所述的一種多食性家蠶的分子育種方法，其特征在于，步驟S2所述sgRNA引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物和下游引物分別如SEQ?ID?NO：4和SEQID?NO：5所示。

7.根據權利要求1所述的一種多食性家蠶的分子育種方法，其特征在于，步驟S2所述PCR的體系為：rTaq酶0.5μL、10×PCR?Buffer?2μL、上游引物2μL、下游引物2μL、dNTP2μL、滅菌水11.5μL。

8.根據權利要求1所述的一種多食性家蠶的分子育種方法，其特征在于，步驟S3所述切割具體為：先以家蠶基因組DNA為模板進行PCR擴增獲取PCR產物，然后按照以下體系進行切割：Cas9蛋白1μL、Cas9蛋白緩沖液1μL、PCR產物200～500ng、sgRNA200～500ng、滅菌水加水至10μL。

9.根據權利要求1所述的一種多食性家蠶的分子育種方法，其特征在于，步驟S4所述sgRNA的注入量為400～600ng/μL，所述cas9蛋白的注入量為400～500ng/μL。

10.權利要求1-9任一項所述的多食性家蠶的分子育種方法在家蠶大規模飼養中的應用。