[發明專利]一種多食性家蠶的分子育種方法及其應用

在審

• 申請號: 202210798614.3
• 申請日: 2022-07-06
• 公開（公告）號: CN116034951A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 黃立華;江健釗;李時宇;馮興暴;袁雅菲;楊振文
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;C12N15/85;C12N15/89;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/12
• 代理公司: 深圳市創富知識產權代理有限公司 44367
• 代理人: 梁嘉朗

本發明屬于農業生物技術領域，涉及家蠶育種技術領域，具體涉及一種多食性家蠶的分子育種方法及其應用。本發明以家蠶味覺受體GR66為靶基因，通過基因編輯技術敲除該基因，改變其食性，促使其能夠取食桑葉以外的非寄主植物，從而變成多食性家蠶，獲得一種多食性家蠶，大大拓寬了家蠶的食譜，既有利于尋找可替代桑葉的非寄主植物來飼養家蠶，也有利于家蠶的大規模飼養，為大規模家蠶飼養提供了一種新的途徑。

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，涉及家蠶育種技術領域，具體涉及一種多食性家蠶的分子育種方法及其應用。

背景技術

家蠶(Bombyxmori?L.)是我國重要的經濟昆蟲，在很多地方都有大量養殖，形成了規模龐大的蠶桑業。經過長期的人工馴化培養，家蠶只能以桑葉為食物，變成了嚴格的單食性昆蟲。然而，桑樹的分布具有較強的地理限制，使得養蠶業主要集中分布于我國的南方區域。并且，由于家蠶只取食新鮮的桑葉，需要專門種植大片的桑樹，這不僅會占用大量的土地，也非常不利于大規模飼養。而解決上述問題的關鍵，是培育多食性的家蠶新品種。

家蠶幼蟲的食性主要決定于位于頭部口器上的下顎組織，有研究表明，通過顯微手術去除家蠶的下顎，家蠶的食性會大大地拓寬，從而能夠取食平時根本不吃的非寄主植物。這主要是因為家蠶的下顎上分布有大量的味覺受體基因，它們負責感受桑葉中特異的次生代謝物。手術去除下顎的同時也會去除這些味覺受體基因，從而使得家蠶不能正確地區分桑葉和非寄主植物，從而能夠取食桑葉以外的植物。

家蠶下顎非常微小，長度通常只有幾個微米。因此，通過手術去除下顎來獲得大量的雜食性家蠶幾乎是不可能的。Crispr/cas9是一種基因組編輯技術，能夠對特定的基因進行缺失突變。因此，采用該方法通過缺失突變從而敲除關鍵的味覺受體基因，也可以達到拓寬家蠶食譜的目的，從而獲得雜食性家蠶品系。雜食性家蠶由于食譜范圍廣泛，有利于研制桑葉以外的替代食物來飼養家蠶。此外，雜食性家蠶由于不挑食，因此也將更適宜于采用人工飼料來進行飼養。因此，有必要開發一種多食性家蠶的分子育種方法。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足，本發明一種多食性家蠶的分子育種方法，獲得一種多食性家蠶，大大拓寬了家蠶的食譜，也有利于家蠶的大規模飼養。

為實現上述目的，本發明是通過以下技術方案來實現的：

本發明提供了一種多食性家蠶的分子育種方法，即通過基因編輯技術使家蠶缺失GR66基因或使家蠶的GR66基因表達量降低，從而培育出多食性家蠶。

優選地，所述基因編輯技術為crispr/cas9技術。

本發明鑒定出了一種味覺受體基因GR66，通過基因編輯技術使家蠶缺失該受體基因后獲得了一種多食性的家蠶新品種，其食譜大大拓寬，可以取食生菜、黑葉小白菜、番薯葉、玉米、蘋果和梨等多種非寄主植物。本發明大大拓寬了家蠶的食譜，為大規模家蠶飼養提供了一種新的途徑。

作為本發明的一個優選實施方式，上述多食性家蠶的分子育種方法，包括以下步驟：

S1、針對家蠶GR66基因設置引物，對家蠶基因組cDNA進行PCR擴增；

S2、以家蠶Gr66基因的外顯區域作為靶位點合成sgRNA引物，然后通過PCR獲得sgRNA的雙鏈DNA，再體外轉錄合成sgRNA；

S3、用步驟S2的sgRNA與cas9蛋白對家蠶基因組DNA進行切割，獲取具有體外切割活性的sgRNA；

S4、將步驟S3的sgRNA與cas9蛋白一起注入發育早期的家蠶卵內，然后將鑒定出GR66基因發生了移碼突變的陽性個體與野生型個體交配，再從下代挑選發生了移碼突變的陽性個體進行自交，最后從自交后代中鑒定出純合的缺失突變體，即為多食性家蠶。