[發明專利]一種用于超微量核酸全自動提取的納米硅羧基磁珠的制備方法及應用

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• 申請號: 202210797140.0
• 申請日: 2022-07-08
• 公開（公告）號: CN115069222A
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 周勇;郭嘉
• 申請（專利權）人: 杭州聯碩生物醫藥科技有限責任公司
• 主分類號: B01J20/22
• 分類號: B01J20/22;B01J20/28;B01J20/30;C12N15/10
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本發明公開一種用于超微量核酸全自動提取的納米硅羧基磁珠的制備方法及應用，是將磁性納米Fe₃O₄顆粒的表面包裹一層高濃度的硅羥基再進行羧基化；制得的硅羧基磁珠為核殼結構，包括Fe₃O₄納米顆粒內核，SiO₂和?COOH外殼層，Fe₃O₄納米顆粒外表面包覆多個SiO₂?COOH外殼層；制得的硅羧基磁珠形狀規則，分散性好，飽和磁化強度高，硅羧基磁珠粒徑均一，對核酸的吸附性強，提取核酸純度高，適用自動化。

技術領域

本發明屬于磁珠技術領域和醫學檢驗技術領域，特別是涉及一種用于超微量核酸全自動提取的納米硅羧基磁珠的制備方法及應用。

背景技術

核酸包括脫氧核糖核酸 (RNA) 和核糖核酸 (DNA) 兩類，是由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質之一，核酸廣泛存在于所有動植物細胞、微生物體內，生物體內的核酸常與蛋白質結合形成核蛋白，不同的核酸其化學組成、核苷酸排列順序等不同，為了能夠更加仔細的研究核酸，需要對其進行提取，在生物醫學的各個領域也離不開核酸的提取。目前，磁珠已被廣泛應用于多個領域，磁珠法作為新的核酸提取方法，因其操作簡單，不需要負壓或反復離心，且易于自動化等優點受到了越來越廣泛的應用。 磁珠本質是四氧化三鐵（Fe₃O₄）包裹有機基團后在特殊的溶液中具有較強結合核酸的能力，有機硅羧基團在特定緩沖液中可以有效的結合核酸，在有磁場條件下，具有能夠從溶液中將其分離出來的特性，利用這個特性能夠將目的核酸從不同的樣品中提取分離出來。磁珠在外磁場的作用下可以定向移動和集中，撤去外磁場后，又可以恢復原來的結構與狀態，從而結合在DNA，雜質不會結合到磁珠上，將混合于復雜體系中的脫氧核糖核酸分離變得快捷簡便。

但是由于現有磁珠大小不一，表面活性基團不足，核酸親和力弱，其提取核酸收率和純度不高，難以滿足生物醫學領域的需求，并且對生物樣品的需求仍在上百毫克，故難以保證對珍貴或稀有的人體組織等樣品的核酸的高效提取純化。

發明內容

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種用于超微量核酸全自動提取的納米硅羧基磁珠的制備方法，其工藝流程簡單，操作簡便，原料成本低，適宜于工業化大批量生產；并且制得的磁珠結構與市面上現有的磁珠結構不同，大小更加均勻，可以大幅度提高核酸提取的效率，實現超微量提取核酸的技術方案；同時提供上述磁珠在多種來源的超微量核酸提取中的應用，通過簡單的洗脫步驟去除雜質，得到高純度DNA/RNA。

一種用于超微量核酸全自動提取的納米硅羧基磁珠的制備方法，包括以下步驟：

步驟一，超順磁性甘油修飾的Fe₃O₄納米顆粒的制備：配置0.5mol/L的可溶性三價鐵離子鹽加入到乙二醇溶液中，攪拌均勻后加入CH₃COONa·3H₂O至體系PH為中性，然后將該混合溶液倒入密閉容器中，在150～300℃條件下反應6～12h，冷卻至室溫后，磁分離出黑色沉淀，用去離子水反復洗滌沉淀物數次，-10℃冷凍干燥12h，得到超順磁性甘油修飾的Fe₃O₄納米顆粒；加入無水乙醇，得到納米磁珠無水乙醇混合液；超聲振蕩納米磁珠無水乙醇混合液25～35分鐘后，加入硅烷化試劑，室溫下攪拌6～8小時，磁分離，即得到硅基包被磁珠。

步驟二，制備Fe₃O₄-SiO₂-COOH納米硅羧基磁珠：取上述步驟一中獲得的的硅基包被磁珠2g及羥基丁二酸2g 于100 ml 的水溶液中90℃充分攪拌反應2小時，用雙蒸水洗至PH中性,并真空干燥，獲得Fe₃O₄/SiO₂-COOH納米硅羧基磁珠。

進一步地，所述步驟一中加入的硅烷化試劑為APTES,SELECTRA-SIL試劑。