[發明專利]一種發酵生產洛伐他汀的土曲霉的培養與保存方法

在審

• 申請號: 202210795097.4
• 申請日: 2022-07-07
• 公開（公告）號: CN114958625A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 鄭召霞;葛翠鳳;張衛;劉洪鵬;伍雄輝;孟曉妍
• 申請（專利權）人: 福安藥業集團煙臺只楚藥業有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/04;C12R1/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本申請提供了一種發酵生產洛伐他汀的土曲霉的培養與保存方法，1)取一支土曲霉甘油冷凍管，采用無菌劃線法接種至平板培養基上，然后培養，獲取單菌落；2)挑選單菌落至無菌試管中，然后加入已滅菌的氯化鈉溶液和無菌玻璃珠，然后振蕩粉碎；3)吸取菌懸液至斜面培養基上，將菌懸液涂布均勻，然后培養；4)向成熟后的菌種斜面加入無菌水，然后轉移至甘油溶液中，然后渦旋混勻，得到甘油菌懸液；5)分裝至冷凍管中；6)冷凍保存；對平板培養基與斜面培養基的配方和菌種保存進行優化，土曲霉發酵能力提高了40%?60%，菌種穩定，甘油菌懸液的均一性良好，操作簡易，成本低，原材料與設備來源廣泛，適合大規模工業化生產。

技術領域

本發明屬于醫藥生產技術領域，尤其是涉及一種發酵生產洛伐他汀的土曲霉的培養與保存方法。

背景技術

洛伐他汀是由土曲霉(Aspexgillus terrrus)發酵而得到，是一種羥甲基戊二酸輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，最早由默克公司在20世紀初從美國的土壤中分離制得，它能顯著降低低密度脂蛋白膽固醇，也比較適合于甘油三脂輕中度升高的患者，并具有較好的安全性，因而于1987年獲得FDA批準上市的新型調整血脂藥，被譽為治療心血管系統疾病的里程碑。

發明內容

本發明的目的是提供一種發酵生產洛伐他汀的土曲霉的培養與保存方法。

為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為：

一種發酵生產洛伐他汀的土曲霉的培養與保存方法，包括以下依次進行的步驟：

1)取一支土曲霉甘油冷凍管，采用無菌劃線法接種至平板培養基上，然后培養，獲取單菌落；

2)挑選單菌落至無菌試管中，然后加入已滅菌的氯化鈉溶液和無菌玻璃珠，然后振蕩粉碎；

3)吸取菌懸液至斜面培養基上，將菌懸液涂布均勻，然后培養；

4)向成熟后的菌種斜面加入無菌水，然后轉移至甘油溶液中，然后渦旋混勻，完成后制備成甘油菌懸液；

5)分裝至冷凍管中；

6)冷凍保存。

優選的，步驟1)中，平板培養基的配制方法為：配制1000mL培養基，加酵母提取物1g～3g，麥芽提取物5g～10g，蛋白胨2g～5g，甘油2g～5g，葡萄糖3g～6g，瓊脂20g-30g，然后調節pH至6.5±0.5，然后濕熱滅菌15分鐘～30分鐘，滅菌壓力為0.12±0.02MPa,滅菌溫度為121℃～124℃。

優選的，酵母提取物為酵母粉和/或酵母浸膏。

優選的，步驟1)中，土曲霉在平板培養基上培養的溫度為25℃～30℃，培養時間為7天～12天。

優選的，步驟2)中，挑選單菌落的標準為：菌落中央為淺黃色至淺棕色，直徑2cm～3cm；

加入2mL已滅菌的質量百分數0.9％的氯化鈉溶液和3～4粒無菌玻璃珠。

優選的，步驟3)中，斜面培養基的配制方法為：配制1000mL培養基，加酵母提取物1g～3g，麥芽提取物5g～10g，蛋白胨2g～5g，甘油2g～5g，葡萄糖3g～6g，瓊脂20g-30g，然后調節pH至6.5±0.5，然后濕熱滅菌15分鐘～30分鐘，滅菌壓力為0.12±0.02MPa,滅菌溫度為121℃～124℃；

吸取0.5mL菌懸液至60mL斜面培養基上。

優選的，步驟3)中，土曲霉在斜面培養基上培養的溫度為25℃～30℃，培養時間為7天～12天。

優選的，步驟4)中，每一支成熟的菌種斜面加20mL～30mL無菌水，甘油溶液的體積濃度為40％～60％，無菌水和甘油溶液的體積比為1:1。