[發明專利]自體子宮內膜提取干細胞的培養方法

在審

• 申請號: 202210792029.2
• 申請日: 2022-07-07
• 公開（公告）號: CN115011547A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 占震鋒;李慶靜
• 申請（專利權）人: 上海南濱江細胞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了細胞培養技術領域，具體為：自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，包括如下操作步驟：S1：取出子宮內膜組織并放置在培養基內，并向培養基內加入1％的生理鹽水和0.9％的抗生素進行浸泡，浸泡完成后利用D?Hanks溶液對子宮內膜組織上殘存的血液進行清洗，S2：清洗完成后放置消化瓶內，并向消化瓶內加入0.2％胰蛋白酶溶液進行消化，消化后放入離心機內進行離心，并去除上層清溶液，通過上述過程可使得子宮內膜干細胞制備的成功率大大提高，縮短了子宮內膜干細胞培養的周期，也能使得子宮內膜干細胞分離成功率得到有效提高。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，具體為自體子宮內膜提取干細胞的培養方法。

背景技術

子宮內膜層是指構成哺乳類子宮內壁的一層。對雌激素和孕激素都起反應，因此可隨著性周期(月經周期)發生顯著的變化，子宮內膜分為功能層和基底層2層。內膜表面2/3為致密層和海綿層統稱功能層，受卵巢性激素影響發生周期變化而脫落。基底層為靠近子宮肌層的1/3內膜，不受卵巢性激素影響，不發生周期性的變化。

干細胞是指一類具有高度增殖潛能、自我更新能力以及高度分化能力的早期未分化細胞。間充質干細胞是目前最受關注的干細胞成員，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，而子宮內膜干細胞是指具有自我更新、多向分化及無限增殖能力的未分化子宮內膜細胞，包括極少量的子宮內膜上皮細胞、子宮內膜間質細胞和大部分的子宮內膜血管內皮細胞。由于子宮內膜干細胞具有取材方便且不受道德及法律問題的限制，使其在實驗研究和臨床應用方面有著廣泛的應用前景。子宮內膜干細胞治療疾病的臨床前研究和臨床試驗，已經被大量的研究，如治療心肌梗死、中風、糖尿病、肝纖維化、肺纖維化、卵巢早衰、慢性缺血性疼痛、肌肉萎縮、骨關節炎。

但是，現有的子宮內膜干細胞提取過程中，子宮內膜的細胞提取的效率較低，且細胞增殖的過程中速率較低，導致細胞培養的效率較差。

因此需要研發自體子宮內膜提取干細胞的培養方法很有必要。

發明內容

本發明的目的在于提供自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，以解決上述背景技術中提出但是現有的子宮內膜干細胞提取過程中，子宮內膜的細胞提取的效率較低，且細胞增殖的過程中速率較低，導致細胞培養的效率較差的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，包括如下操作步驟：

S1：取出子宮內膜組織并放置在培養基內，并向培養基內加入1％的生理鹽水和0.9％的抗生素進行浸泡，浸泡完成后利用D-Hanks溶液對子宮內膜組織上殘存的血液進行清洗；

S2：清洗完成后放置消化瓶內，并向消化瓶內加入0.2％胰蛋白酶溶液進行消化，消化后放入離心機內進行離心，并去除上層清溶液；

S3：接著取出步驟S1離心后的組織，接著利用破碎組織對初次消化后的子宮內膜組織破碎成2mm^3大小的組織塊后放入250mL(外徑70mm*口徑30mm* 瓶高140mm)的藍蓋試劑瓶內；

S4：加入質量/體積比為0.1％的I型膠原酶50mL，并置于恒溫振蕩儀內持續消化5h得到消化液，然后利用100目篩網過濾消化液；

S5：利用D-Hanks溶液將濾網過濾出的子宮內膜細胞沖入離心容器內，接著啟用離心機以2000r/min離心5-10min對子宮內膜溶液進行離心，取出上層清液，并將底層的細胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培養基內進行培養；

S6：利用培養基將細胞培養貼壁60％后把培養基轉移到無菌環境下將細胞接種至接種瓶內，并將接種瓶移植到CO²孵箱內培養；

S7：3天后全量換為MMSC Basal Medium培養液，棄去未貼壁的細胞與雜質，根據細胞生長情況，每2天換液一次；