[發明專利]自體子宮內膜提取干細胞的培養方法

在審

• 申請號: 202210792029.2
• 申請日: 2022-07-07
• 公開（公告）號: CN115011547A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 占震鋒;李慶靜
• 申請（專利權）人: 上海南濱江細胞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，其特征在于：包括如下操作步驟：

S1：取出子宮內膜組織并放置在培養基內，并向培養基內加入1％的生理鹽水和0.9％的抗生素進行浸泡，浸泡完成后利用D-Hanks溶液對子宮內膜組織上殘存的血液進行清洗；

S2：清洗完成后放置消化瓶內，并向消化瓶內加入0.2％胰蛋白酶溶液進行消化，消化后放入離心機內進行離心，并去除上層清溶液；

S3：接著取出步驟S1離心后的組織，接著利用破碎組織對初次消化后的子宮內膜組織破碎成2mm^3大小的組織塊后放入250mL(外徑70mm*口徑30mm*瓶高140mm)的藍蓋試劑瓶內；

S4：加入質量/體積比為0.1％的I型膠原酶50mL，并置于恒溫振蕩儀內持續消化5h得到消化液，然后利用100目篩網過濾消化液；

S5：利用D-Hanks溶液將濾網過濾出的子宮內膜細胞沖入離心容器內，接著啟用離心機以2000r/min離心5-10min對子宮內膜溶液進行離心，取出上層清液，并將底層的細胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培養基內進行培養；

S6：利用培養基將細胞培養貼壁60％后把培養基轉移到無菌環境下將細胞接種至接種瓶內，并將接種瓶移植到CO²孵箱內培養；

S7：3天后全量換為MMSC Basal Medium培養液，棄去未貼壁的細胞與雜質，根據細胞生長情況，每2天換液一次；

S8：獲得的細胞長到80％融合時，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，顯微鏡下觀察，控制消化時間，待胞質回縮，加含10％FBS的DMEM/F12培養液終止消化；

S9：將細胞懸液1000rpm離心3min，原代細胞以1:1的比例進行傳代，記為P1代，傳代第二天培養液換為MesenPRORSa-MMedium培養液，P2代以后按1:8的比例傳代，直至細胞彼此融合。

2.根據權利要求1所述的自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟S2中，所用的0.2％胰蛋白酶溶液與子宮內膜的體積比為1:2或者1:3。

3.根據權利要求1所述的自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟S4中，恒溫震蕩儀在工作時設置的溫度為37℃。

4.根據權利要求1所述的自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟S5中，DMEMF/12培養基中的成分為FBS(胎牛清血)10％，3ug/ml兩性霉素B，慶大霉素90U/ml或雙抗1-3％，bFGF18ng/ml。

5.根據權利要求1所述的自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟S6中，接種瓶內細胞的密度為10³cm²～10⁵cm²。

6.根據權利要求1所述的自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟S6中，CO²孵箱的飽和濕度為100％，工作的溫度為37℃，CO²的含量為5％。

7.根據權利要求1所述的自體子宮內膜提取干細胞的培養方法，其特征在于：所述0.9％的抗生素為慶大霉素，濃度為25mg/L。