[發明專利]一種優化環介導等溫擴增反應的方法

在審

• 申請號: 202210761203.7
• 申請日: 2022-06-30
• 公開（公告）號: CN115029420A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 崔大祥;李雪玲;田靜;仲禺俊;沈琦;李玥
• 申請（專利權）人: 國納納米技術研究（河北）有限公司;上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12R1/42;C12R1/01
• 代理公司: 上海東亞專利商標代理有限公司 31208
• 代理人: 董梅

本發明公開了一種優化環介導等溫擴增反應的方法，屬于生物技術領域。本發明所提供的方法為將石蠟塊加入到環介導等溫擴增反應體系當中進行核酸擴增，同時，在反應混合物中不包括甜菜堿。本發明方法可有效提高環介導等溫擴增反應的靈敏度，并且能夠抑制假陽性結果的出現、減少非特異性擴增，從而提高的檢測效率?？梢员粦糜谑称钒踩珯z測等領域，具有廣泛應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種優化環介導等溫擴增反應的方法。

背景技術

環介導等溫擴增反應（Loop-mediated isothermal amplification，縮寫為LAMP）是一種在等溫條件下進行核酸擴增的技術，可以廣泛應用于食品安全檢測等領域。該技術靈敏度高，在等溫條件下擴增15min-1h即可產生10⁹～10¹⁰倍的擴增子，若實驗環境被氣溶膠污染，則很容易產生假陽性結果。另外，由于擴增反應過程中涉及到多條引物，引物間很容易發生非特異性結合產生引物二聚體，從而消耗反應體系中的反應底物，降低反應效率和檢測靈敏度，同時又容易導致結果假陽性，使得結果誤判。因此，如何優化環介導等溫擴增反應體系，使得其既有較高檢測靈敏度、又抑制非特異性擴增，一直是該技術領域急需解決的技術難題。

發明內容

克服現有環介導等溫擴增檢測技術中所遇到的由于靈敏度高、實驗環境易被氣溶膠污染以及多條引物間發生非特異性結合而容易產生假陽性和靈敏度降低的問題，本發明提供一種優化環介導等溫擴增反應的方法。以便進一步提高檢測的靈敏度、抑制非特異性擴增，解決在環介導等溫擴增檢測方面遇到的技術難題。

本發明通過以下方案解決所述的技術問題：一種優化環介導等溫擴增反應的方法，通過向環介導等溫擴增反應體系中添加石蠟塊同時避免使用甜菜堿來實現反應體系優化，包括如下步驟：

（1）在反應管底部加入反應混合物I；

（2）加入石蠟塊，蓋上管蓋，60℃融化、冷卻，其中，石蠟塊的用量為：如在25μL的核酸擴增反應體系中加入石蠟塊融化后的體積為8μl；

（3）加入反應混合物II；

（4）進行等溫擴增反應；

（5）核酸擴增產物檢測：通過電泳檢測、濁度檢測或顯色檢測。

本發明通過向環介導等溫擴增反應體系中添加石蠟塊，同時避免使用甜菜堿的方法來實現優化效果，提供了一種優化環介導等溫擴增反應的方法。采用本發明的檢測方法檢測，具有高靈敏度和高特異性的優點。

進一步的，加入的石蠟塊的熔點為48-50℃。

本發明方法中，反應混合物I包括但不限于dNTP、外引物F3和B3、內引物FIP和BIP、Bst DNA聚合酶、聚合酶緩沖液、Mg²⁺ 、MnCl₂。反應混合物I不包括甜菜堿。

本發明方法中，反應混合物II包括但不限于dNTP、外引物F3和B3、內引物FIP和BIP、Bst DNA聚合酶、聚合酶緩沖液、Mg²⁺、MnCl₂。反應混合物II不包括甜菜堿。

本發明方法中，在一具體實施方案中，所述反應混合物包括dNTP 1.0-1.6 mmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，內引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，Bst DNA聚合酶8 U，1×聚合酶緩沖液，Mg²⁺ 2-9 mmol/L。例如，1× Bst DNA聚合酶反應緩沖液可以選用1×Thermopol反應緩沖液，包含Tris-HCl (pH 8.8) 20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，(NH4)₂SO410 mmol/L，0.1% Triton X-100，MgSO₄ 2 mmol/L。本發明方法中，所述等溫擴增反應的反應程序為①60～65℃孵育10～90 min；②80℃終止反應2~20 min。本發明不限制通過其他適宜反應程序來實現本發明檢測方法。