[發(fā)明專利]hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210760745.2
• 申請(qǐng)日: 2022-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN114931128A
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祖堯;武秀知;賀經(jīng)緯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): A01K67/027
• 分類號(hào): A01K67/027;C12N15/85;C12N15/89;C12N15/113;A61K49/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 周一新

本發(fā)明公開了hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法和應(yīng)用，依次包括設(shè)計(jì)gRNA位點(diǎn)—PCR擴(kuò)增—gRNA的模板純化—體外轉(zhuǎn)錄—gRNA純化—顯微注射—檢測(cè)敲除效率—飼養(yǎng)至成魚—與野生型交配—檢測(cè)下一代胚胎是否攜帶突變位點(diǎn)—飼養(yǎng)成年后剪尾鑒定出雜合突變體—兩雜合體交配得到純合突變體的步驟。本發(fā)明首次運(yùn)用CRISPR技術(shù)刪除基因組中hoxaa基因簇長(zhǎng)片段構(gòu)建hoxaa基因簇缺失的斑馬魚突變體，其可用于與hoxaa基因簇相關(guān)疾病的動(dòng)物模型研究hoxa基因在動(dòng)物體生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制和基因缺失引起的相關(guān)疾病治療。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

CRISPR/Cas技術(shù)是繼ZFN及TALEN后近幾年比較火熱的基因編輯系統(tǒng)，基于其具有簡(jiǎn)單、高效、易操作等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)在全球多種模式生物中得到廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于古生物菌和細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)，一早被發(fā)現(xiàn)僅需要兩段RNA及Cas9一種核酸內(nèi)切酶就可以對(duì)靶位點(diǎn)行使切割功能，由于其僅依賴傳統(tǒng)的Watson-Crick方式識(shí)別20nt的核苷酸，很快被改良并應(yīng)用到哺乳動(dòng)物及人類細(xì)胞中并且實(shí)現(xiàn)了有效的切割，此后相繼將CRISPR技術(shù)在小鼠、斑馬魚、果蠅、細(xì)菌等模式生物上進(jìn)行應(yīng)用并獲得成功。

hox是編碼含有同源框的一大類轉(zhuǎn)錄因子家族，在動(dòng)物軀體形態(tài)構(gòu)建中發(fā)揮重要作用。hox基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了全基因組的加倍，最先發(fā)現(xiàn)的果蠅中只含有一個(gè)hox基因簇，小鼠等四足動(dòng)物中發(fā)生了兩次全基因組的加倍，形成4個(gè)Hox基因簇，斑馬魚等大多數(shù)硬骨魚發(fā)生了額外一次的基因組加倍，最終形成7～8個(gè)hox基因簇，斑馬魚中有7個(gè)hox基因簇，共48個(gè)基因成員。hox基因在染色體上成簇排列，不同的hox基因簇分布在不同的染色體上，每個(gè)hox基因簇由多個(gè)同源組基因組成。hox基因的表達(dá)遵循時(shí)間-空間共線性表達(dá)模式空間共線性是指：位于3’端的hox基因表達(dá)部位越靠近軀體前端，而位于5’端的基因則大多在軀體后端表達(dá)；時(shí)間共線性是指：3’端的hox基因比5’端的基因表達(dá)得要早。時(shí)間-空間共線性表達(dá)模式使得hox基因在軀體形態(tài)構(gòu)建中按照一定的順序發(fā)揮特定的功能。hoxa基因編碼在肢體發(fā)育過程中起作用的重要的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生和骨骼分化。在這些基因中，hoxa11和hoxa13被認(rèn)為在從魚類到四足動(dòng)物的神秘進(jìn)化過渡中發(fā)揮重要作用。

哺乳動(dòng)物擁有39個(gè)hox基因，這些基因排列在四個(gè)線性簇中，每個(gè)簇有9至11個(gè)基因。hoxa基因家族編碼包含DNA結(jié)合同源異型盒基序的蛋白質(zhì)，并控制除后期發(fā)育事件之外的早期胚胎分割模式。hoxa基因家族與多種癌癥類型相關(guān)，目前有研究表明hoxa基因家族與急性髓性白血病(AML)有關(guān)，影響細(xì)胞更新和白血病的發(fā)展。2005年，Tischfield報(bào)道人類hoxa1基因的純合缺失會(huì)導(dǎo)致阿薩巴斯卡發(fā)育不良綜合征(ABDS)，其特征表現(xiàn)為面部畸形、面部麻痹、頸動(dòng)脈形成缺陷等。hoxa1基因的突變還會(huì)導(dǎo)致先天性人類hoxa1綜合征的Bosley-Salih-Alomainy綜合征(BSAS)，患者通常會(huì)出現(xiàn)以下癥狀：眼動(dòng)、內(nèi)耳空腔畸形、腦血管異常、心臟畸形、發(fā)育遲緩和自我認(rèn)知障礙，還有部分患者會(huì)出現(xiàn)從單側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈發(fā)育不良到雙側(cè)發(fā)育不全的腦血管畸形。在正常發(fā)育過程中，hoxa13在身體后部結(jié)構(gòu)的形成中起著主導(dǎo)作用，特別是在肢體、腸道和泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育中，也在腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮相關(guān)作用，并且hoxa13基因在癌變和腫瘤進(jìn)展過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制使其可以作為癌癥診斷和治療的生物標(biāo)志物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法，通過CRISPR技術(shù)構(gòu)建hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體魚系。

本發(fā)明的另一目的是提供通過上述制備方法得到的hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體作為動(dòng)物模型的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：