[發明專利]hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法和應用

在審

• 申請號: 202210760745.2
• 申請日: 2022-06-30
• 公開（公告）號: CN114931128A
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 祖堯;武秀知;賀經緯
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/85;C12N15/89;C12N15/113;A61K49/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 周一新

1.hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，通過CRISPR技術構建，依次包括設計gRNA位點—PCR擴增—gRNA的模板純化—體外轉錄—gRNA純化—顯微注射—檢測敲除效率—飼養至成魚—與野生型交配—檢測下一代胚胎是否攜帶突變位點—飼養成年后剪尾鑒定出雜合突變體—兩雜合體交配得到純合突變體的步驟，具體包括以下步驟：

(1)獲取斑馬魚的hoxaa基因簇序列；

(2)在斑馬魚hoxa13a基因的第一個外顯子上設計如SEQ ID NO:1所示的靶點gRNA序列，在hoxa1a基因的第一個外顯子上設計如SEQ ID NO:2所示的靶點gRNA序列；

(3)設計并合成hoxa13a基因的gRNA引物F1和R1以及hoxa1a基因的gRNA引物F2和R2，序列分別如SEQ ID NO:3-6所示；

(4)設計并合成hoxa13a基因的檢測引物F3和R3以及hoxa1a基因的檢測引物F4和R4，序列分別如SEQ ID NO:7-10所示；

(5)以gRNA骨架質粒為模板使用步驟(3)的gRNA引物進行PCR擴增反應，電泳檢測PCR產物，純化；

(6)在RNase-Free條件下將上述PCR純化產物分別進行體外轉錄得到gRNA，轉錄體系中加入T7聚合酶和NTP，37℃反應1.5h，純化；

(7)將步驟(6)純化后的兩種gRNA和Cas9蛋白混合后顯微注射到斑馬魚單細胞期胚胎中，24h后取胚胎并提取DNA，用上述F3/R4這一對引物對敲除位點進行PCR擴增，電泳檢測PCR產物，將敲除成功的小魚飼養長大，作為F₀；

(8)待F₀斑馬魚性成熟后，與野生型的斑馬魚雜交得到一定概率的雜合子，取胚胎并提取DNA，用上述F3/R4這一對引物對敲除位點進行PCR擴增，電泳檢測PCR產物并測序確認，將有突變的斑馬魚培養長大，作為F₁；

(9)待F₁斑馬魚性成熟后，將雌魚和雄魚的魚尾切除進行尾鰭DNA提取，按照上述方法進行PCR擴增確認是否突變并測序確認，將有突變的雌雄斑馬魚配對，取后代魚卵進行檢測，先用上述F3/R4這一對引物進行PCR檢測，陽性結果的基因組用F3/R3或者F4/R4引物檢測單個基因的完整性，陰性結果即純合子，將其后代養大，作為F₂；

(10)待F₂斑馬魚性成熟后，將F₂所有的魚剪尾提取DNA，按上述方法檢測得到hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體。

2.根據權利要求1所述hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，PCR反應條件為：預變性94℃3min；變性94℃30s，退火65℃30s，延伸72℃30s進行35個循環，再72℃10min，最后保溫在12℃。

3.根據權利要求1所述hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，步驟(7)中，PCR反應條件為：預變性94℃3min；變性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃40s進行35個循環，再72℃10min，最后保溫在12℃。

4.根據權利要求1所述hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，步驟(7)中，hoxa13a和hoxa1a基因的gRNA終濃度均為100ng/μL，Cas9蛋白的終濃度為800ng/μL，注射量為1nL。

5.根據權利要求1所述hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，F₀斑馬魚、F₁斑馬魚和F₂斑馬魚性成熟的時間均為3-4個月。

6.hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體，通過權利要求1至5任一項所述hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體的制備方法得到。

7.根據權利要求6所述的hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體，其特征在于，所述hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體中刪除的hoxaa基因簇大小為56.6kb。

8.權利要求6或7所述的hoxaa基因簇缺失斑馬魚突變體在構建與hoxaa基因簇缺失相關疾病的動物模型和藥物篩選中的應用。