[發明專利]一種定性檢測母乳中酸性低聚糖的方法

有效

• 申請號: 202210757416.2
• 申請日: 2022-06-30
• 公開（公告）號: CN115112799B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 陳歷俊;張明輝;喬為倉;趙軍英;賈舸;王亞玲;劉妍;陳璟瑤;劉茜;楊寶雨;楊軼涵
• 申請（專利權）人: 北京三元食品股份有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/60;G01N30/72
• 代理公司: 北京悅和知識產權代理有限公司 11714
• 代理人: 司麗春

本發明涉及一種定性檢測母乳中酸性低聚糖的方法，依次按下述步驟進行：(1)將母乳離心，去除上層脂肪和蛋白質，取離心產物的中間層；(2)加入乙醇，靜置反應；(3)離心，取上清；(4)利用層析柱吸附，先用超純水水洗，后用氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液；(5)將洗脫液通過液質聯用進行分析。本發明提供的定性檢測母乳中酸性低聚糖的方法，通過對提取工藝以及液相色譜和質譜參數的改進，使該方法可以準確的對來源于母乳樣品的9種酸性低聚糖進行定性測定，同時，本方法還具備良好的重復性，適用于大規模的母乳樣品的分析工作。

技術領域

本發明涉及檢測領域，特別涉及一種定性檢測母乳中酸性低聚糖的方法。

背景技術：

在母乳中，母乳低聚糖(HMOs)是3-10個單糖由共價鍵連接組成的短鏈聚合物。HMOs由半乳糖(Galactose,Gal)，葡萄糖(Glucose,Glc)，N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)，巖藻糖(Fucose,Fuc)和唾液酸(Sialic acid,Sia)五種基礎單糖聚合而成。其中唾液酸在母乳中存在形式是N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)。HMOs通常根據其化學電荷可分為兩類：不含電荷的單糖(Glu，Gal，GlcNAc，Fuc)組成的中性低聚糖和帶有Neu5Ac負電荷殘基的酸性低聚糖。酸性低聚糖占HMOs總量的12-14％。母乳低聚糖具有促進大腦發育，調節腸道菌群，抗病毒，預防壞死性小腸結腸炎和調節上皮細胞和免疫細胞等功能。母乳中可能含有上千種低聚糖，但由于地理差異、泌乳階段、分娩方式和遺傳基因等因素的影響，會導致HMOs種類和含量發生變化。目前可以通過毛細管電泳、液相色譜、液相色譜-質譜和離子色譜等方法對HMOs進行定性定量的檢測。HMOs種類繁多，且含量和種類變化復雜，用奶粉模擬母乳是特別復雜且困難的事情。建立對母乳中HMOs定性檢測的方法，對母乳中不同種類的低聚糖進行含量變化的研究，總結出HMOs的種類和含量變化規律，這將以便于以后對嬰幼兒配方奶粉中HMOs的添加提供依據，有利于配制出與中國母乳較為接近的嬰幼兒配方奶粉。

因鑒于此，特提出此發明。

發明內容

本發明的目的旨在提供一種定性檢測母乳中酸性低聚糖的方法，該方法可實現對母乳中酸性低聚糖的分離提取和定性檢測。

為了實現上述目的，本發明提供了一種定性檢測母乳中酸性低聚糖的方法，依次按下述步驟進行：

(1)將母乳離心，去除上層脂肪和蛋白質，取離心產物的中間層；

(2)加入乙醇，靜置反應；

(3)離心，取上清；

(4)利用層析柱吸附，先用超純水水洗，后用氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液；

(5)將洗脫液通過液質聯用進行分析。

優選或可選地，步驟(1)中離心的具體條件為3-5℃下8000-10000rpm離心25-35min，優選的，離心條件為4℃下10000rpm離心30min。

優選或可選地，步驟(2)中，加入乙醇的體積與步驟(1)中獲得的中間層產物的體積比為2-3:1,優選為2:1。

優選或可選地，步驟(2)中，靜置反應的環境溫度為零下17-零下23℃，反應時間為25-35min，優選的，環境溫度為零下20℃，反應時間為30min。

優選或可選地，步驟(3)中，離心的具體條件為3-5℃下3000-5000g離心25-35min，優選的，離心條件為4℃下4000g離心30min。

優選或可選地，步驟(4)中，所使用的的層析柱為Cleanert IC-A，且在吸附前經超純水活化。

優選或可選地，步驟(4)中，所用的氯化鈉溶液的濃度為40-60mmol/L。