[發明專利]東佛里生奶綿羊冷凍精液制備方法

在審

• 申請號: 202210750285.5
• 申請日: 2022-06-29
• 公開（公告）號: CN114903032A
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 張磊;宋宇軒;姜璐遙;劉曉瑞;衛夢瑤;崔久增;李丹妮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 東莞市卓易專利代理事務所(普通合伙) 44777
• 代理人: 陳桂香

本發明公開了一種東佛里生奶綿羊冷凍精液的制備方法，包括精液的稀釋和冷凍。本發明的的東佛里生奶綿羊冷凍精液制備方法能夠有效保護奶綿羊精液冷凍、解凍過程中精子的生理機能，從而延長精子存活時間，達到受精受胎的目的。

技術領域

本發明屬于綿羊冷凍精液技術領域，特別涉及一種適用于東佛里生奶綿羊精液冷凍的稀釋液配方和冷凍程序。

背景技術

精液冷凍保存技術可以打破時間和空間的障礙長期保存精液，提高優良種公羊的利用率，加快品種改良的進程，是人工授精技術的關鍵環節之一。近幾年，國內家畜精液冷凍保存的硬件水平得到質的提升。繼牛之后，豬冷凍精液也開始步入商業化生產進程。

在研究過程中，由于羊精子，特別是綿羊精子的特異性及其在冷凍和解凍過程中，很多問題和影響因素尚未研究清楚，目前在綿羊精液冷凍試驗中，大多數冷凍精液解凍后總活率不能穩定在50％以上。故至今使用凍精配種的情期受胎母羊率仍處在30-50％的水平，而且還很不穩定，綿羊冷凍精液距離實現商業化生產、銷售還有一定差距。

發明內容

(一)要解決的技術問題

為了提高綿羊冷凍精液解凍后活力以及存活時間，提升綿羊冷凍精液品質，本申請發明人在超低溫情況下，綿羊精子在超微結構、生理生化等方面的變化、活性物質損失、以及在生物學上和功能上的損傷等方面潛心研究，終于發現大多數冷凍精液解凍后總活率不能穩定在50％以上是因為綿羊精子質膜中不飽和脂肪酸含量很高，膽固醇含量較低，使得綿羊精子在低溫和冷凍過程中更容易遭受結構損傷，因此本申請設計一種東佛里生奶綿羊冷凍精液制備方法能夠有效保護奶綿羊精液冷凍、解凍過程中精子的生理機能，從而延長精子存活時間，達到受精受胎的目的。

(二)技術內容

本發明提供了一種東佛里生奶綿羊冷凍精液的制備方法，該技術原理是利用含有葡萄糖、乳糖、檸檬酸鈉、卵黃、甘油、青霉素和鏈霉素的精液冷凍稀釋液對精液進行稀釋，在為精子提供能量的同時保護東佛里生奶綿羊精子結構；同時利用5℃～-10℃內-5℃/min， -10℃～-100℃內-40℃/min，-100℃～-140℃內-20℃/min的降溫程序進行冷凍，減少冰晶的形成，從而降低冷凍解凍過程對東佛里生奶綿羊精子造成的損傷，提高解凍后精子活力和延長精子存活時間，達到受精受胎的目的。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種東佛里生奶綿羊冷凍精液制備方法，其特征在于，它包括以下步驟：

(1)精液冷凍稀釋液的配制：

將葡萄糖3.1g，乳糖4.6g，檸檬酸鈉1.5g，加85mL超純水溶解，調節pH至7，用0.22μm濾器過濾；加入青霉素、鏈霉素各5萬單位和15mL卵黃，得到Ⅰ液，放至 38℃水浴鍋中保存備用；

取配制好的Ⅰ液，加入6％甘油，調節pH至7后得到Ⅱ液，4℃保存備用。

(2)精液檢查

①外觀評定

1)射精量：采精后用移液器移至有刻度的無菌離心管中觀察；

2)色澤：東佛里生奶綿羊的正常精液呈乳白色或乳黃色；

3)云霧運動：用肉眼觀察新采集的東佛里生奶綿羊公羊精液，可以看到由精子活動所引起的翻騰滾動似云霧狀；精子密度越大，活力越強，其云霧狀越明顯。

②活力檢測

用移液器從1)的離心管中取適量精液滴在載玻片上，壓片后至于顯微鏡下鏡檢，活率≥80％即可進行冷凍；

(3)精液稀釋

①Ⅰ液稀釋：取Ⅰ液按照1：1的比例分步稀釋至精子終濃度計算所需體積的一半，每次添加后輕輕搖勻，用18層紗布包裹放至4℃中平衡1.5-2h；